RNA 的提取

RNA 提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。在有EB 存在时，完整未降解的RNA制品电泳图谱应可清晰看到18S rRNA、28S rRNA 两条带，也应当能看到一条由tRNA、5.8SrRNA 和5S rRNA 组成的、较模糊迁移较快的条带，且28S rRNA 条带亮度应为18S rRNA的1.5-2 倍。

1、试剂耗材的准备：

（1） 试剂：

A. RNase-Free 水：配0.01 % （v/v）的Diethylpyr℃arbonate（DEPC）溶液，室温保持过夜，次日高压灭菌后，- 20 ℃ 保存。

B. 氯仿 （Chloroform），异丙醇（Isopropyl alcohol），分子生物学级别C. 75% 乙醇 （用 DEPC-treated 水配制）

（2） RNase 去除的耗材：用0.01% （v/v） DEPC 溶液完全浸泡过夜，高压灭菌后烘干。

2、实验步骤：

（1） 准备分离RNA 的细胞：

I. 悬浮细胞：

收集细胞，离心200 g，5 min。吸出培养液。每10 6 个细胞加入1 mL Trizol 裂解液，反复吹吸3 - 5 次，室温下静置10 min 后转移至干净的离心管中。

II. 贴壁细胞：

吸出培养液，每10 cm 2 生长面积的细胞加入1 mL Trizol 裂解液，反复吹吸3 - 5次，室温下静置10 min 后转移至干净的离心管中。

（2） 加入0.2 mL 氯仿（/ mL Trizol），振荡15 sec 混匀后静置2 min。

（3） 在4 ℃，12，000 g 离心15 min，混合液分成三层。

（以下所有步骤用到耗材均需用DEPC 处理并高压灭菌。）

（4） 小心吸取最上层的无色水层于干净的离心管中。加入0.5 mL 异丙醇（/ mL Trizol），室温下静置10 min。

（5） 在4 ℃，12，000 g 离心10 min，弃上清，加入1 mL 75% 乙醇（/ mL Trizol），振荡混匀。

（6） 在4 ℃，7，500 g 离心5 min，弃上清。室温下完全干燥5 - 10 min。

（7） 加入RNase‐Free 水溶解RNA 沉淀，分装后在80 ℃ 保存