Northern Blot实验方法

[ 仪器 、试剂、材料] （一） 仪器 恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。 （二）材料 总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜 （三） 试剂 NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。 [方法与步骤] 1. 用具的准备： 180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。 电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。 处理DEPC水(2 L)备用。 2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染 用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。 3．制胶： 1． 称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分) 2． 在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。 注意尽量避免产生气泡。 3． 将熔胶倒入制胶板中，插上梳子 如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5cm。 4．胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250ml　1＊MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。） 5．检查点样孔。 4. RNA样品的制备 在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB（终浓度为10ug/ml）。混匀后，65℃空气浴15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。 5. 电泳： 1. 将RNA样品小心加到点样孔中。 2. 在5V/cm下跑胶（5ｘ14cm）。在电泳过程中，每隔30min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。 3. 紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。 注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。 6. 转膜 1．用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。 2．用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。 3．连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm），膜在Transfer buffer浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。 4．盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。 5．将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。 6．将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。 7．打开真空泵，使压强维持在50~58mbar；立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10min在胶面加上1ml transfer buffer，真空转移2小时。 8．转膜后，用镊子夹住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒，去除残余的胶和盐。 9．用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。 10．将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间) 12．将膜在-20℃保存。