改良热硼酸盐法提取RNA

（1）取3 g样品，加入10% 样品重的多聚聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），用液氮研磨成细粉状，将细粉分为每份约3 g，并贮藏于-80℃下。

（2）在50 ml falcon管中加入20 ml提取缓冲液。提取液的组成为0.2 mol/L 脱水四硼酸钠（sodium tetriborate decahydrate）、30 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）、1% （W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）、1%脱氧胆酸钠盐。

再加入0.0309 g二硫苏糖（DTT）、200 ul乙基苯基聚乙二醇（NP-40）和0.4 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40），并置于80℃下平衡15 min。

取出于-80℃中保存样品，加入热平衡后的提取缓冲液，振荡混匀。再加入800 ul蛋白酶K（20 mg/ml ），盖好管盖，平放于转速为120 r/min 、温度为42℃摇床上，摇动提取1.5 h。

（3）之后，向样品管中加人1.6 ml 2 mol/LKCl，振荡混匀，将样品管置于4℃条件下1~1.5h。将提取液转移至玻璃离心管中，在4℃条件下以12 000×g离心20 min。取上清液置于新的玻璃离心管中，加入1/4（或1/3）体积8 mol/L LiCl（~20℃），振荡混匀，于4℃放置过夜。

4℃下以12 000×g离心20 min，去除上清液，RNA沉淀滞留于管底。加入3~5 ml冷的2 mol/L （4℃）LiCl，轻缓振荡，4℃下以12 000×g离心10 min，去除上清液。重复2 mol/L LiCl清洗2~3次，直到上清中无色素类物质。

（4）用2 ml 10 mmol/L。Tris-HCl（pH 7.5）充分溶解沉淀，4℃下以12 000×g离心10 min，去除不溶性的沉淀，将上清液转移至15 ml玻璃离心管中，加入200 ul（1/10体积）的2 mol/L 醋酸钾（pH 5.5）。于4℃温浴中放30 min。4℃下以12 000×g离心10 min。

将上清液转移至新的玻璃离心管中，加入2.5倍体积的100% 乙醇，摇匀并置于-80℃条件下沉降RNA 1~2 h。

（5）4℃下9 800×g离心30 min，去除上清液，RNA沉淀滞留于管底。用1~2 ml 70%冷乙醇（-20℃）清洗沉淀，4℃下9 800×g离心5 min，去除上清液。室温下干燥RNA沉淀（20~30 min）至管内无水珠。

（6）用200 ul经过焦碳酸二乙醇（DEPC）处理的超纯水充分溶解沉淀。溶解液完全转移至1.5ml离心管中，再用100 ul经过DEPC处理的超纯水清洗原管壁和管底，将清洗液合并于RNA溶解沉淀中，加入1/10体积3 mol/L 醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的100% 冷乙醇，混匀后放置于-20℃沉降RNA 1 h。

混合液在4℃下以16 000×g离心30 min，去除上清液，用1~2 ml 70% 冷乙醇（-20℃）清洗管底滞留的RNA沉淀，4℃下以9 800×g离心5 min，去除上清液，RNA沉淀滞留管底。

（7）RNA沉淀于室温下干燥20~30 min。用适量经过EDPC处理的超纯水（100~300 ul）溶解RNA沉淀，RNA液置于-80℃条件下可长期保存，或用于分析。