mRNA的分离与纯化

真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7 G）和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+ ）表示。

这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。

mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。

此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+ ）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。

寡聚(dT)纤维素柱纯化 mRNA

一、试剂准备

1．3M醋酸钠（pH 5.2）

2．0.1M NaOH

3．1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。

4．洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS

5．无水乙醇、70%乙醇

6．DEPC

二、 操作步骤

1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。

2．用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。

3．使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。

4．将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。

5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。

6．用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260 测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260 值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260 值很低或无吸收。

7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+ )RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。

8．OD260 测定Poly(A+ )RNA分布，合并含Poly(A+ )RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。

9．4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A+ )RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。

10. 用适量的DEPC H2O溶解RNA。

三 、注意事项

1．整个实验过程必须防止Rnase的污染。

2．步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+ )尾处的二级结构，使Poly(A+ )尾充分暴露，从而提高Poly(A+ )RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。

3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。

4．寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。

5．一般而言，107 哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+ )RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。