核酸的抽提---mRNA的分离技巧

与rRNA 和tRNA 不同的是，哺乳动物细胞的绝大部分mRNA 在其3'端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA 中分离mRNA dmonds等，1971;At Leder，1972）。在构建cDNA文库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA 模板。

进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时，与总RNA 相比，采用poly(A)+ RNA 能获得更为满意的结果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制备Oligo(dT)－纤维素，也可以买现成的产品。

1）用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纤维素。

2）将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为1m的oligo(dT)－纤维素最大量为10mg总RNA ，如果总RNA 的量较少，则应减少oligo(dT)－纤维素的使用量以防止poly(A)+RNA 在过柱以及后续步骤中损失。

3）用无菌的1x层析柱加样缓冲液冲洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x层析柱加样缓冲液

20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)

0.5mol/L NaCl

1mmol/L EDTA(pH8.0)

0.1%SDS

可按以下方法制备灭菌的层析柱加样缓冲液；将适量无RNA 酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化钠和EDTA贮存液混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高压下蒸气灭菌，待其次序却至65℃左右时加入已在65℃预热30分钟的10 %SDS贮存液。也可以用0.05mol/L柠檬酸钠代替Tris.Cl 然后用DEPC处理柠檬钠－NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。

4）用灭菌水溶解RNA ，于65℃温育5分钟后使迅速冷却至室温，加等体积的2x层析柱加样缓冲液，上样，立即用灭菌的试管收集洗液。 当所的RNA 溶液均进入柱床后，加1倍体积的1x层析柱加样 ，继续收集洗出液。加热RNA 可以破坏可能涉及poly(A)尾的二级结构。

5）当全部溶液流出后，将收集液置于65℃温育5分钟，重新上样，并收集流出液。

6）用5-10倍柱床体积的1x层析柱加样缓冲液洗柱，分部收集洗出液，测定每一收集管的OD260。最补由于不带poly)A)的RNA 洗过柱床， OD260会很高，后来OD260值则很小或为零。在某些方案中，上述步骤后还用5倍柱术体积的含0.1mol/L NaCl的1x 层析柱加样缓冲液洗柱床，然而由于洗出的不带poly(A)的RNA 很少甚至没有， 因此这一步骤可以省略。

7）用2－3倍柱床体积的经灭菌且无RNA 酶的洗脱缓冲液洗脱mRNA ，以1/3－1/2柱床体积分部收集洗脱液。洗脱缓冲液

10mmol/L Tris.Cl(pH7.6)

1mmol/L EDTA(pH8.0)

0.05%SDS

用于配制洗脱缓冲液的Tris. Cl 和EDTA贮存液应为新近高压的溶液 可用适量的灭菌水稀释上述贮存液配制洗脱缓冲液。洗脱缓冲液不能高压处理，因高压会使溶产生大量气泡。

8）收集液置于透明的小溶器内，测定OD260， 使用前比色杯须用浓盐酸：甲醇（1：1）浸泡1小时，再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗合并含有RNA 的洗脱组分。经上述一轮oligo(dT)－纤维素亲和量层析后得到的RNA 中，带与不带poly(A)的RNA ，其含量近乎相等。

如欲进一步纯化mRNA ，可将洗脱液于65 ℃温育3分钟，迅速冷却至室温，加入NaCl至终浓度为0.5mol/L，用同一oligo(dT)纤维素柱进行第二轮层析。

9）收集oligo(dT)－纤维素柱层析的洗脱液，在mRNA 溶液中加入3mol/L乙酸钠（pH5.2）至终深度为0.3mol/L并混匀。加2.5 倍体积用冰预冷的乙醇，混匀，冰浴至少30分钟。

10）于4℃以10 000g离心15分钟回收poly(A)+RNA ，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀（通常看不见沉淀），离心片刻，在空气中晾干核酸沉淀。

11）用少量水重溶RNA ，置于比色杯内，测定OD260， 使用前比色杯须用浓盐酸：甲醇（1：1）浸泡1小时，再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗

12）将mRNA 溶液由比色杯移至聚丙烯离心管内，加3倍体积乙醇， 混匀，于－70℃保存备用。回收RNA 时，只需取出一小份贮存液，加3mol/K乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L， 混匀，用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。

i.OD260＝1的溶液其RNA 含量约为40μg/ml。

ii.从107个哺乳动物培养细胞中可获得1－5μg mRNA ，所得mRNA 通常只占上柱的总RNA 的1～2%