RNAi技术历史背景、作用机理与路线图

一、RNAi的概念与产生的历史背景

随着分子 生物 学的飞速发展，一些新分子 生物 学技术正在不断孕育和产生，RNAi技术成为新的分子生物学研究热点，独占分子生物学新技术的鳌头。

近年来研究表明，一些小的双链RNA（dsRNA）可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，即称为RNA干扰（RNA interference, RNAi，也称RNA干预或干涉或沉默）。

其实，它是生物体内抵御外在感染的一种重要保护机制。由于可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具。自1998年被发现以来，在其作用机制研究、应用于生物基因组中特定基因功能的研究、封闭和阻断病原体基因表达等方面，取得了重要进展，显示出良好的应用前景。

RNAi技术正在功能基因组学领域掀起一场真正的深刻革命，并将彻底改变这个领域的研究步伐。

为此，《Science》杂志和美国科学促进会将RNAi技术评为2002年度最重大的十大科学成就之首，成为2002年度最耀眼的明星，是生物医学领域近20年来，可与HGP相提并论的最重大成果之一。

认为该项技术将对治疗肿瘤、爱滋病、肝炎等多种威胁人类健康的重大疾病带来希望。

二、RNAi的作用机理

RNAi最主要的作用是一小段（大约21-23bp）的双链RNA分子（double-strainded RNA,dsRNA）它介导细胞内序列特异性基因表达阻断或封闭，也就是转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）,从而起到控制细胞的各种高级生命活动。

1. RNAi的作用水平

RNAi是在多重水平上发挥作用的。最先在华丽新小杆线虫中发现，dsRNA所诱导的基因沉默在转录后水平，因为dsRNA导致了相应RNA（mRNA）的降解，而基因启动子和内含子序列作为基因沉默触发物则无效。后来在植物中也发现，RNAi引起的基因沉默也是在转录后水平。

除此转录后水平降解mRNA的机制外，RNAi还通过其他机制来影响基因表达。在植物中，dsRNA导致基因组中与沉默触发物同源序列的甲基化；如果与沉默触发物与启动子序列相同，则引起转录水平的基因沉默 。而另外的研究还发现，在华丽新小杆线虫中，RNAi装置中，内源性编码的诱导剂，是在蛋白质合成水平发挥作用的。

2. RNAi的作用的基本过程

第一步：起始步 沉默触发物被裂解，产生小干扰性RNA（small interfering RNAs，siRNAs）。研究表明，果蝇胚胎提取物就有将长链dsRNA底物裂解为长度在约22bp小片段的活性。这些siRNAs是双链的，有磷酸化的5ˊ端。这一过程，可能与Rnase Ⅲ家族的功能有关。

该家族中有一类已被命名为Dicer酶，含2个催化结构域、1个螺旋酶结构域和1个PAZ基序。遗传学研究表明，Dicer酶结构在多种生物体之间比较保守。

第二步：效应步 siRNAs与多种亚单位形成复合物—RNA诱导的沉默复合物（RISC），然后以RISC的方式降解单链的靶mRNA。在RISC中，这种大小约22bp的siRNAs所起的作用，是以碱基配对的原则，识别与dsRNA相同序列的靶mRNA，引导复合物中的RNA降解酶RNase，确保对特定的序列的靶mRNA进行降解。

第三步：沉默效应的放大和扩散 在华丽新小杆线虫中，RNAi能够扩散到整个虫体，即使只有少量的触发物dsRNA；在植物中也发现了相似的情况，沉默效应扩散到整株植物，并可转移到嫁接的幼芽。

研究发现，西红柿中RNA指导的RNA 聚合酶 （RdRP）与RNAi的扩散有关；而华丽新小杆线虫和植物中dsRNA诱导的基因沉默所需要参与的蛋白质，在序列上与西红柿的这种RdRP很相似；在其他生物体中，起RdRP作用的分别可能是：拟南芥属—SDE1/SGS2，脉孢菌属—QDE-1，胚系华丽新小杆线虫—EGO-1，华丽新小杆线虫成虫—RRF-1/RDE-9；而病毒诱导的基因沉默（VIGS），则是螺旋酶。有学者认为，沉默效应的放大和扩散，是RdRP激发了另外的dsRNA合成。