核糖核酸酶保护实验相较于Northern的优势与问题分析

核糖核酸酶保护实验（Ribonuclease protection assay，RPA）是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA；未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化，故该方法命名为RNA酶保护实验。对于32P标记的探针，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护的探针的信号；对于生物素标记的探针，杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜，采用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。

　　RPA是一种有力的工具，可用于检测在总RNA混合物中特定mRNA分子的表达。尽管操作比较复杂，但是这种方法可以在一次检测中分析多达25样品。敏感性和高通量的优点使得RPA在病原体的发现中显得非常有用。由RPA得到的结果，结合普通的形态学技术有助于阐明疾病的发生过程。

　　RPA有Northern Blot无法比拟的优势：

　　1. 过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全

　　2. RPA比Northern Blot灵敏15-150倍，适合检测各种表达水平之基因

　　3. RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达

　　4. 一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度

　　这个方法的的主要缺点如下：

　　1. 这个实验的前提是你必须首先要把要研究的基因克隆于一个载体，要清楚插入片段的方向，该载体插入片段两侧有T3、T7或SP6的启动子位点。载体先要用合适的内切酶线性化，选择正确的体外转录试剂盒，转录出要研究的mRNA 的互补链，再纯化。总之RNA探针的制备够麻烦。

　　2. 核酸酶消化时，酶量的控制困难，容易消化过头，X片上什么都没有。

　　3. 要用放射性同位素。从事生物研究的人谁不接触放射性物质?但是该方法中不同于一般的探针标记，体积小，防护容易。它需要做垂直板状PAGE，还要漂洗固定，粘有放射性的物质太多，如电泳的缓冲液、电泳槽、玻璃板、漂洗固定液及托盘。这还没有算上RNA探针标记及随后的纯化过程。

　　可能出现的问题及应对措施：

　　1. No Discrete Bands, Only Smears--RNA degraded, or the the RNase Digestion was too harsh.Try reducing the concentration of RNase A to 1 mg/ml or digest for a shorter period of time. Check your RNA for condition.

　　2. Bands Too Large, High Molecular Weight Artifacts--The RNase Digestion was inefficient and unable to effectively trim down the RNA:RNA duplexes.Try RNasing longer or increasing the RNase concentration. /Incompletely linearized template DNA.

　　3. Bands in the Negative Control Lane --Inefficent RNase Digestion （see above）/Sense template contaminating riboprobe/Insufficent DNase digestion of riboprobe.

　　4. Many Lower Molecular Weight Bands Under the Main Band--There can either be premature stop sites in the probe leading to smaller probe sizes, therefore smaller products. This can also stem from overdigestion by RNase A which will break-up the duplexes if the concentration or digestion time is too long.

　　5. No Signal At All: You did generate an antisense probe right?

　　RPA和SAGE的相同点和不同点：

　　两者的相同点都在于根据不同的RNA分子有不同的特征序列，以此为依据，分析基因的表达情况；两者的不同点在于，具体检测RNA的原理不一样，相比较而言，前者利用RNase只消化单链RNA（即未与RNA probe结合的RNA分子）的特性，定性兼半定量分析特定（视合成的probe）基因的表达，后者是基于只需14bp长的核酸序列即可代表一个RNA分子，用扩增的方式，定性的研究可以检测到一个细胞内所有转录体的表达