筛选已知RNA序列的相互作用蛋白
原理酵母三杂交系统（yeast three-hybrid system）可用于分析蛋白质与 RNA 间的相互作用。在酵母三杂交系统中，RNA 蛋白质相互作用导致
原理
酵母三杂交系统（yeast three-hybrid system）可用于分析蛋白质与 RNA 间的相互作用。在酵母三杂交系统中，RNA 蛋白质相互作用导致报道基因的转录，可以通过细胞生长、克隆颜色或特异的酶活性检测蛋白质与 RNA 的相互作用。
材料与仪器
YPD 和 SD 培养基 鲑精 DNA PEG 3350 TE 缓冲液 LiAc DMSO Z 缓冲液
步骤
一、引入 RNA 质粒和 cDNA 文库
通常首先将 RNA 质粒转化到宿主菌株-L40coat 内，得到包含 RNA 质粒的细胞，再转化一个融合了转录激活区的 cDNA 文库（杂交 RNA 对宿主细胞几乎没有毒性，与用于双杂交筛选的一些杂交蛋白诱饵不同，所以，没必要将两个质粒共转染），转化混合物铺于缺乏亮氨酸和组氨酸的培养基上，不需要保持 RNA 质粒（如 ADE2 或者 URA3 选择）。这样就允许细胞在没有 RNA 或丢失 RNA 质粒的情况下激活 HIS3，能够利用克隆颜色筛选。
下面是简便的酵母感受态细胞制备方法和质粒与文库的转化方法。
1. 酵母感受态细胞的制备（LiAc 法）
需要准备的试剂包括：YPD 和 SD 培养基；各种缺陷型氨基酸添料：鲑精 DNA ( 10 mg/mL，用前需 100℃ 变性 20 min，而后立即置冰上）；50% PEG 3350；TE 缓冲液； LiAc ( 1 mol/L，pH 7.5）；DMSO。
(1) 提前 2~3 天将酵母菌转接一次至相应的培养板上（YPD），一周内可用。
(2) 挑几个直径 2~3 mm 的克隆接入含 10 ml YPD 的大试管，剧烈振荡，打散。
(3) 于 30℃，230~270 r/min 培养 16~18 h，培养至 OD600 ＞1.5。
(4) 将过夜培养物转接至含 200 ml YPD 的三角瓶中，培养至 OD600 为 0.2~0.3。
(5) 于 30℃，230~270 r/min 振荡培养 3 h，培养至 OD600 为 0.4~0.6。
(6) 将培养物分装至 50 ml 离心管中，于室温 2200 r/min 离心 5 min。
(7) 弃上清，加入 25~50 ml 无菌水或 TE 重悬。
(8) 于室温 2200 r/min 离心 5 min。
(9) 弃上清，加入 1 ml 新鲜配制的无菌 1XTE/LiAc 重悬。至此感受态细胞制备完成。
2. 质粒/文库的转化
(1) 准备 PEG/LiAc 溶液 10 ml。
(2) 将质粒或文库 DNA 与鲑精 DNA 混匀，加入 0.1 ml 感受态细胞，振荡混匀。
(3) 加入 0.6 ml PEG/LiAc，振荡混匀。
(4) 于 30℃，200 r/min 振荡培养 30 min。
(5) 加 70 μl DMSO，上下颠倒，温和混匀。
(6) 于 42℃ 水浴热激 15 min。
(7) 置冰上 1~2 min。
(8) 于 14000 r/min 室温离心 5 s。
(9) 弃上清，用 0.5 ml TE 重悬酵母细胞。
(10) 涂板，于 30°C 培养约 3~4 天长出菌落。
需要说明的是，可以把 HIS3 基因的一种产物的竞争性抑制剂-3-氨基三唑（3-AT）加到平板中以选择更强的相互作用。一些 RNA 可自身微弱地激活报道基因，许多蛋白也可不依赖杂交 RNA 而微弱地激活报道基因，这两种情况都产生 “假阳性”。为了消除由 RNA 诱饵产生的激活，在起始转化之前，应该用一个只携带 RNA 质粒的菌株来滴定 3-AT。为了减少蛋白假阳性的数量（“RNA 非依赖的” 阳性），在 2~5 mmol/L 范围内的 3-AT 是一个好的起始点，它们提供了一个抑制背景和允许 “真” 阳性生长之间合理的平衡。RNA-蛋白相互作用的亲和性在体外的数据对于决定应该便用的 3AT 浓度有参考价值。在一个与其 RNA 靶标体外相互作用很强的 SLBP 的筛选中，含 25 mmol/L 的 3-AT，可大大降低背景。
二、通过克隆颜色去除不依赖 RNA 的假阳性
从起始转化中可得到两类阳性。一类转化需要杂交 RNA 激活 HIS3 报道基因，这些称作 “RNA依赖的”。第二类阳性在杂交 RNA 存在或不存在时都可激活 HIS3，这些称作 “RNA 非依赖的”。RNA 非依赖的阳性可能携带能结合报道基因启动子区的蛋白，或可直接与 Lex A-MS2 包装融合蛋白相互作用，这种 RNA 非依赖的转化可能非常多，甚至占所有克隆数的 95% 以上。
为了去除 RNA 非依赖性的假阳性，我们采用了在 RNA 质粒上接 ADE2 基因的方法。宿主菌株是一个 ade2 的突变体。当培养板中腺苷酸水平变低时，细胞幵始合成腺苷酸，并且因为缺少 ADE2 编码的酶而积累一种红色的嘌呤代谢物，此积累使细胞呈现粉红色或者红色，而携带野牛型 ADE2 基因的细胞是白色的。
在起始转化中，只选择激活 HIS3，而不是保持 RNA 质粒，对于 RNA-依赖的阳性，HIS3 选择不是直接选择携带 ADE2 基因的 RNA 质粒；因此这些转化子是白色的，如果它们继续在没有外源 His 的条件下生长将保持这样。然而，非依赖的阳性不需要 RNA 质粒激活 HIS3 基因，这样就可能失去以每个世代百分之几频率工作的质粒，所以这些假阳性生成粉红菌落或部分粉红的白色菌落。
起始的转化平板通常在 30℃ 培养一周。这段时间允许阳性克隆积累 HIS3 基因产物和生长，并且提供了足够的时间产生颜色。如果一周后粉红色不浓，4℃ 过夜可增强效果。弃去粉红色或者部分粉红的克隆，挑选完全的白色菌落进一步分析。我们通常选择所有白色菌落 ( 典型的为几个大的，很多小的克隆），并且再次在选择性培养基上选择包含 cDNA 质粒和 RNA 质粒的克隆。多数小的白色克隆是 RNA 非依赖的，不能生长。能在选择培养基上生长的白色克隆用来进一步分析。
用克隆颜色来识别 RNA 依赖的阳性并不完美，许多 RNA 非依赖的阳性能被识别并弃掉。多数白色克隆可能是 RNA 非依赖的。在 E.coli 中复苏质粒之前从白色克隆中严格除掉剩下的 RNA 非依赖的激活子是非常重要的。
三、β-Gal 活性分析
为了确证包含 cDNA 的白色克隆通过酵母三杂交激活，需要检测 lacZ 基因的表达水平。在 L40coat 菌株中，lacZ 基因整合到染色体上，位于 Lex-A 结合位点的控制下。
β-Gal 活性分析可以通过检测乳糖转变为发光产物来分析，用浸在滤纸上的克隆或细胞裂解液来进行分析。滤纸测定法能产生定性结果，而液体测定法更能定量分析。
需要准备的试剂包括，Z 缓冲液：60 mmoI/L Na2HPO4·7H2O，40 mmol/L NaH2PO4·H2O，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgSO4·7H2O，50 mmol/L β-巯基乙醇，调 pH 至 7.0，高压灭菌；Z 缓冲液/X-Gal 溶液：100 ml Z 缓冲液，0.27 ml β-巯基乙醇，1.67 ml X-Gal 储液。
1. 定性（滤纸）测定法
(1) 从步骤二 “通过克隆颜色去除不依赖 RNA 的假阳性” 划克隆至合适的选择性培养基（SD-Leu-Ura）上，并培养过夜。
(2) 复制克隆至平板大小的硝酸纤维素膜或滤纸上（Whatman，3 MM )。
(3) 液氮中处理 20 s。
(4) 菌落面朝上，室温溶解滤膜（大约 2 min )。
(5) 剪几张与皮氏培养皿大小一致的滤纸，滤纸用 Z 缓冲液/300 μg/ml X-Gal 饱和，X-Gal 应使用新鲜的，去除多余的缓冲液。
(6) 将滤膜放在浸透的滤纸上，用封口膜封平板。
(7) 30℃ 孵育过夜，定期检査滤膜，观察颜色改变。
强的相互作用 ( 如 TRE 和 IRP ) 会在 30 min 内变蓝，弱的相互作用如果延长孵育时间最终也会产生蓝色。由于这个原因，有规律的检查滤膜以确定花费多长时间出现颜色是很重要的。
2. 定量（液体）测定法（ONPG 法）
β-Gal 的特异活性在酵母细胞裂解液中，可以使用不同的底物来测定。通常采用 ONPG 或 CPRG ( 氯酚红-D-半乳糖吡喃糖苷) 比色法分析，CPRG 更为敏感，但较昂贵。另外发光底物提供了高敏感性，且并不贵。下面方法应用了发光底物-Galacton-Plus ( Tropix，Bedford，MA），这种分析需要检测发光的装置。下面的操作方法适用于 Monolight 2010 发光仪（Analytic Luminescent 实验室，CA )。这种分析的细节，如样品量，随使用仪器的不同而不同。
(1) 对每组待测的相互作用，均培养 3 份酵母单菌落至 5 ml 选择性培养基（SD/Leu Trp His）中，于 30℃，230~250 r/min 摇过夜。
(2) 培养至 OD600 值约为 0.8。
(3) 对于每组相当于 1.0 OD 细胞的沉淀，用 100 μl 裂解缓冲液（100 mmol/L 磷酸钾，pH 7.8，0.2% Triton X-100 ) 重悬。
(4) 冻融裂解细胞。液氮浸 30 s 后，37°C 放置 90 s，连续 3 个循环。
(5) 取 100 μl 菌液加入 1.5 ml 离心管，同时设空白对照管（100 μl Z 缓冲液）。
(6) 简单混旋各管。
(7) 于 12000 g 离心。
(8) 收集上清进行发光分析，如果有必要，可将样品于 -70°C 保存。
(9) 加 10 μl 裂解物到发光仪的试管中。对于强的相互作用，有必要稀释裂解液以保证在线性范围内分析。
(10) 用反应缓冲液（100 mmol/L 磷酸钠，1 mmol/L 氯化镁，pH 8.0）1：100 稀释 Galacton 底物。每个发光仪试管中加 100 μl。
(11) 25℃ 孵育 60 min。
(12) 直接用发光仪测定发光情况。
(13) 用 Bradford 或同等方法测定裂解液中蛋白浓度。
(14) 蛋白浓度对化学发光标准化，得到特异的活性。
四、纯化 RNA 质粒再次检测
在步骤二 “通过克隆颜色去除不依赖 RNA 的假阳性” 中利用克隆颜色筛选可以消除绝大多数但并非全部不依赖 RNA 的假阳性。为了确定阳性确实为 RNA 依赖的，RNA 质粒需要 URA3 抗性筛选。然后检测报道基因的表达，对不能激活报道基因的候选分子进一步分析。
为了筛选掉丢失 RNA 质粒的细胞，可将细胞铺在含有 5-FOA ( 5-fluorouracil acid）的培养板上。5-FOA 可被 URA3 基因的产物转变为具有毒性的 5-fluorouracil。缺乏 URA3 基因产物的细胞可以在含有 5-FOA 的培养板上生长，而含有 URA3 基因产物的不能。
1. 从步骤二 “通过克隆颜色去除不依赖 RNA 的假阳性” 中挑选阳性克隆到 SD-Leu 平板、生长一天使细胞丢失质粒。
2. 复制至 SD-Leu 含 0.1% 5-FOA 的平板，30℃ 孵育几天。
3. 长出的细胞划线至 SD-Ura 平板上以确定 RNA 质粒的丢失。通过简单的 5-FOA 抗性筛选通常是有效的。
4. β-Gal 活性分析。
RNA 质粒上的 ADE2 标记在检测 RNA 质粒丟失中是有用的。丢失 RNA 质粒的细胞几天后可变为粉色。如果阳性克隆数较少，就可不用较贵的 5-FOA，细胞就可直接于富营养培养基中培养过夜，然后铺于 SD-Leu 平板上。几天后一些克隆将变粉色或部分粉色。均一粉色的克隆即丢失了 RNA 质粒，可以再作 β-Gal 活性分析。
五、用突变和对照 RNA 确定结合的特异性
为了确定 RNA 结合的特异性，重新将编码不同杂交 RNA 的质粒导入菌株，如果阳性克隆较少，可以将不同的 RNA 质粒转化入菌株，其余一般用交配法导入质粒，可以用 R40 coat 菌株。下面是简单的交配法的操作方法。
1. 在 SD-Ura 平板上培养携带特异杂交 RNA 质粒（如突变型对野生型）的 R40coat 转化子菌落。
2. 划格法从 5-FOA 平板复制 Ura 克隆至 YPD 平板。
3. 将每个 R4coat 菌落复制至同一个 YPD 平板。
4. 于 30℃ 培养过夜进行交配。
5. 复制平板到 SD-Leu-Ura 平板上选择二倍体。
6. β-Gal 活件分析。
RNA 用于特异性分析。步骤四 “纯化 RNA 质粒再次检测” 存活的阳性克隆带有相对于细胞 RNA 优先结合杂交 RNA 的蛋白。虽然这些阳性识别杂交 RNA 的一些特点，它们不一定是与生物活性相关的因子。因此，理想的对照是精细的突变影响生物功能或以序列特好的方式影响相互作用。在一些情况下，反义诱饵可以用来做二级结构或碱基组成的对照。
真正 RNA 依赖的阳性克隆的分级。最初，阳性克隆分级生理上的相关性是不可预测的，因为蛋白的功能很多（在随机筛库时），相互作用的强度，在起始转化中用的 3-AT 的浓度，以及其他参数等。
没有微小的 RNA 突变可用怎么办？必须设计另外的方法来鉴定这些阳性克隆。很显然，功能测试是理想的，但在很多组织和系统中，这是费时又费力的。cDNA 序列可以通过直接与已知 RNA 结合蛋白或预期的分子质量（基于如 UV 交联获得）对比，获得信 息。由于毎种情况都是特异的，我们就不在这里提供通用的讨论了。然而，必须提醒的是二次筛选是很关键的。
六、鉴定阳性 cDNA
1. 从酵母细胞中提出显示出预期 RNA 结合特异性的 cDNA 质粒，转化到 E.coli 中。酵母细胞可能包含多种 cDNA 质粒，只有其中一种编码的蛋白结合 RNA。因此，应该从多个 E.coli 转化子中提取出质粒，重新转入酵母以保证获得正确的质粒。下面是一个简单的操作方法，所有的步骤都在室温进行。
(1) 牙签挑酵母单克隆至 50 μl 裂解液 [ 2% Triton X-100，1% SDS，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA ]。
(2) 加 50 μl 酚：氯仿和 0.1 g 酸洗的玻璃珠。
(3) 高速混旋 2 min。
(4) 高速离心 5 min。
(5) 转移上清至一干净的试管中，乙醇沉淀 DNA。70% 乙醇洗后干燥沉淀。
(6) 用 10 μl 水重悬沉淀。用 1 μl 电转化 E.coli。
2. 为了方便确定多少质粒在一个酵母转化子中，我们通常用裂解的酵母克隆进行 PCR 扩增，用插入片段的侧翼序列做引物。下面是酵母克隆进行 PCR 的操作方法。
(1) 用无菌枪头接触酵母克隆。
(2) 将枪头浸泡 10 μl 反应缓冲液 [ 1.2 mol/L 山梨糖醇，100 mmol/L 磷酸钠（pH 7.4)，2.5 mg/ml 酶解酶 ]，上下吹打几次，于 37℃ 孵育 5 min。
(3) 取 1 μl 进行 20 μl 体系 PCR 反应。如果需要，PCR 产物可以用色谱纯化或凝胶中纯化后直接测序。
七、功能测试或其他筛选
通常需要其他的步骤来鉴定那些阳性克隆的生物学意义。如前面（步骤五 “用突变和对照 RNA 确定结合的特异性”）所说那些筛选都是独特的，依赖于相互作用和研究的组织。用 RNA 诱饵的筛选中，鉴定出不相关的 RNA 结合蛋白是不奇怪的，而只是个合理的相互作用分子。
通常首先将 RNA 质粒转化到宿主菌株-L40coat 内，得到包含 RNA 质粒的细胞，再转化一个融合了转录激活区的 cDNA 文库（杂交 RNA 对宿主细胞几乎没有毒性，与用于双杂交筛选的一些杂交蛋白诱饵不同，所以，没必要将两个质粒共转染），转化混合物铺于缺乏亮氨酸和组氨酸的培养基上，不需要保持 RNA 质粒（如 ADE2 或者 URA3 选择）。这样就允许细胞在没有 RNA 或丢失 RNA 质粒的情况下激活 HIS3，能够利用克隆颜色筛选。
下面是简便的酵母感受态细胞制备方法和质粒与文库的转化方法。
1. 酵母感受态细胞的制备（LiAc 法）
需要准备的试剂包括：YPD 和 SD 培养基；各种缺陷型氨基酸添料：鲑精 DNA ( 10 mg/mL，用前需 100℃ 变性 20 min，而后立即置冰上）；50% PEG 3350；TE 缓冲液； LiAc ( 1 mol/L，pH 7.5）；DMSO。
(1) 提前 2~3 天将酵母菌转接一次至相应的培养板上（YPD），一周内可用。
(2) 挑几个直径 2~3 mm 的克隆接入含 10 ml YPD 的大试管，剧烈振荡，打散。
(3) 于 30℃，230~270 r/min 培养 16~18 h，培养至 OD600 ＞1.5。
(4) 将过夜培养物转接至含 200 ml YPD 的三角瓶中，培养至 OD600 为 0.2~0.3。
(5) 于 30℃，230~270 r/min 振荡培养 3 h，培养至 OD600 为 0.4~0.6。
(6) 将培养物分装至 50 ml 离心管中，于室温 2200 r/min 离心 5 min。
(7) 弃上清，加入 25~50 ml 无菌水或 TE 重悬。
(8) 于室温 2200 r/min 离心 5 min。
(9) 弃上清，加入 1 ml 新鲜配制的无菌 1XTE/LiAc 重悬。至此感受态细胞制备完成。
2. 质粒/文库的转化
(1) 准备 PEG/LiAc 溶液 10 ml。
(2) 将质粒或文库 DNA 与鲑精 DNA 混匀，加入 0.1 ml 感受态细胞，振荡混匀。
(3) 加入 0.6 ml PEG/LiAc，振荡混匀。
(4) 于 30℃，200 r/min 振荡培养 30 min。
(5) 加 70 μl DMSO，上下颠倒，温和混匀。
(6) 于 42℃ 水浴热激 15 min。
(7) 置冰上 1~2 min。
(8) 于 14000 r/min 室温离心 5 s。
(9) 弃上清，用 0.5 ml TE 重悬酵母细胞。
(10) 涂板，于 30°C 培养约 3~4 天长出菌落。
需要说明的是，可以把 HIS3 基因的一种产物的竞争性抑制剂-3-氨基三唑（3-AT）加到平板中以选择更强的相互作用。一些 RNA 可自身微弱地激活报道基因，许多蛋白也可不依赖杂交 RNA 而微弱地激活报道基因，这两种情况都产生 “假阳性”。为了消除由 RNA 诱饵产生的激活，在起始转化之前，应该用一个只携带 RNA 质粒的菌株来滴定 3-AT。为了减少蛋白假阳性的数量（“RNA 非依赖的” 阳性），在 2~5 mmol/L 范围内的 3-AT 是一个好的起始点，它们提供了一个抑制背景和允许 “真” 阳性生长之间合理的平衡。RNA-蛋白相互作用的亲和性在体外的数据对于决定应该便用的 3AT 浓度有参考价值。在一个与其 RNA 靶标体外相互作用很强的 SLBP 的筛选中，含 25 mmol/L 的 3-AT，可大大降低背景。
二、通过克隆颜色去除不依赖 RNA 的假阳性
从起始转化中可得到两类阳性。一类转化需要杂交 RNA 激活 HIS3 报道基因，这些称作 “RNA依赖的”。第二类阳性在杂交 RNA 存在或不存在时都可激活 HIS3，这些称作 “RNA 非依赖的”。RNA 非依赖的阳性可能携带能结合报道基因启动子区的蛋白，或可直接与 Lex A-MS2 包装融合蛋白相互作用，这种 RNA 非依赖的转化可能非常多，甚至占所有克隆数的 95% 以上。
为了去除 RNA 非依赖性的假阳性，我们采用了在 RNA 质粒上接 ADE2 基因的方法。宿主菌株是一个 ade2 的突变体。当培养板中腺苷酸水平变低时，细胞幵始合成腺苷酸，并且因为缺少 ADE2 编码的酶而积累一种红色的嘌呤代谢物，此积累使细胞呈现粉红色或者红色，而携带野牛型 ADE2 基因的细胞是白色的。
在起始转化中，只选择激活 HIS3，而不是保持 RNA 质粒，对于 RNA-依赖的阳性，HIS3 选择不是直接选择携带 ADE2 基因的 RNA 质粒；因此这些转化子是白色的，如果它们继续在没有外源 His 的条件下生长将保持这样。然而，非依赖的阳性不需要 RNA 质粒激活 HIS3 基因，这样就可能失去以每个世代百分之几频率工作的质粒，所以这些假阳性生成粉红菌落或部分粉红的白色菌落。
起始的转化平板通常在 30℃ 培养一周。这段时间允许阳性克隆积累 HIS3 基因产物和生长，并且提供了足够的时间产生颜色。如果一周后粉红色不浓，4℃ 过夜可增强效果。弃去粉红色或者部分粉红的克隆，挑选完全的白色菌落进一步分析。我们通常选择所有白色菌落 ( 典型的为几个大的，很多小的克隆），并且再次在选择性培养基上选择包含 cDNA 质粒和 RNA 质粒的克隆。多数小的白色克隆是 RNA 非依赖的，不能生长。能在选择培养基上生长的白色克隆用来进一步分析。
用克隆颜色来识别 RNA 依赖的阳性并不完美，许多 RNA 非依赖的阳性能被识别并弃掉。多数白色克隆可能是 RNA 非依赖的。在 E.coli 中复苏质粒之前从白色克隆中严格除掉剩下的 RNA 非依赖的激活子是非常重要的。
三、β-Gal 活性分析
为了确证包含 cDNA 的白色克隆通过酵母三杂交激活，需要检测 lacZ 基因的表达水平。在 L40coat 菌株中，lacZ 基因整合到染色体上，位于 Lex-A 结合位点的控制下。
β-Gal 活性分析可以通过检测乳糖转变为发光产物来分析，用浸在滤纸上的克隆或细胞裂解液来进行分析。滤纸测定法能产生定性结果，而液体测定法更能定量分析。
需要准备的试剂包括，Z 缓冲液：60 mmoI/L Na2HPO4·7H2O，40 mmol/L NaH2PO4·H2O，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgSO4·7H2O，50 mmol/L β-巯基乙醇，调 pH 至 7.0，高压灭菌；Z 缓冲液/X-Gal 溶液：100 ml Z 缓冲液，0.27 ml β-巯基乙醇，1.67 ml X-Gal 储液。
1. 定性（滤纸）测定法
(1) 从步骤二 “通过克隆颜色去除不依赖 RNA 的假阳性” 划克隆至合适的选择性培养基（SD-Leu-Ura）上，并培养过夜。
(2) 复制克隆至平板大小的硝酸纤维素膜或滤纸上（Whatman，3 MM )。
(3) 液氮中处理 20 s。
(4) 菌落面朝上，室温溶解滤膜（大约 2 min )。
(5) 剪几张与皮氏培养皿大小一致的滤纸，滤纸用 Z 缓冲液/300 μg/ml X-Gal 饱和，X-Gal 应使用新鲜的，去除多余的缓冲液。
(6) 将滤膜放在浸透的滤纸上，用封口膜封平板。
(7) 30℃ 孵育过夜，定期检査滤膜，观察颜色改变。
强的相互作用 ( 如 TRE 和 IRP ) 会在 30 min 内变蓝，弱的相互作用如果延长孵育时间最终也会产生蓝色。由于这个原因，有规律的检查滤膜以确定花费多长时间出现颜色是很重要的。
2. 定量（液体）测定法（ONPG 法）
β-Gal 的特异活性在酵母细胞裂解液中，可以使用不同的底物来测定。通常采用 ONPG 或 CPRG ( 氯酚红-D-半乳糖吡喃糖苷) 比色法分析，CPRG 更为敏感，但较昂贵。另外发光底物提供了高敏感性，且并不贵。下面方法应用了发光底物-Galacton-Plus ( Tropix，Bedford，MA），这种分析需要检测发光的装置。下面的操作方法适用于 Monolight 2010 发光仪（Analytic Luminescent 实验室，CA )。这种分析的细节，如样品量，随使用仪器的不同而不同。
(1) 对每组待测的相互作用，均培养 3 份酵母单菌落至 5 ml 选择性培养基（SD/Leu Trp His）中，于 30℃，230~250 r/min 摇过夜。
(2) 培养至 OD600 值约为 0.8。
(3) 对于每组相当于 1.0 OD 细胞的沉淀，用 100 μl 裂解缓冲液（100 mmol/L 磷酸钾，pH 7.8，0.2% Triton X-100 ) 重悬。
(4) 冻融裂解细胞。液氮浸 30 s 后，37°C 放置 90 s，连续 3 个循环。
(5) 取 100 μl 菌液加入 1.5 ml 离心管，同时设空白对照管（100 μl Z 缓冲液）。
(6) 简单混旋各管。
(7) 于 12000 g 离心。
(8) 收集上清进行发光分析，如果有必要，可将样品于 -70°C 保存。
(9) 加 10 μl 裂解物到发光仪的试管中。对于强的相互作用，有必要稀释裂解液以保证在线性范围内分析。
(10) 用反应缓冲液（100 mmol/L 磷酸钠，1 mmol/L 氯化镁，pH 8.0）1：100 稀释 Galacton 底物。每个发光仪试管中加 100 μl。
(11) 25℃ 孵育 60 min。
(12) 直接用发光仪测定发光情况。
(13) 用 Bradford 或同等方法测定裂解液中蛋白浓度。
(14) 蛋白浓度对化学发光标准化，得到特异的活性。
四、纯化 RNA 质粒再次检测
在步骤二 “通过克隆颜色去除不依赖 RNA 的假阳性” 中利用克隆颜色筛选可以消除绝大多数但并非全部不依赖 RNA 的假阳性。为了确定阳性确实为 RNA 依赖的，RNA 质粒需要 URA3 抗性筛选。然后检测报道基因的表达，对不能激活报道基因的候选分子进一步分析。
为了筛选掉丢失 RNA 质粒的细胞，可将细胞铺在含有 5-FOA ( 5-fluorouracil acid）的培养板上。5-FOA 可被 URA3 基因的产物转变为具有毒性的 5-fluorouracil。缺乏 URA3 基因产物的细胞可以在含有 5-FOA 的培养板上生长，而含有 URA3 基因产物的不能。
1. 从步骤二 “通过克隆颜色去除不依赖 RNA 的假阳性” 中挑选阳性克隆到 SD-Leu 平板、生长一天使细胞丢失质粒。
2. 复制至 SD-Leu 含 0.1% 5-FOA 的平板，30℃ 孵育几天。
3. 长出的细胞划线至 SD-Ura 平板上以确定 RNA 质粒的丢失。通过简单的 5-FOA 抗性筛选通常是有效的。
4. β-Gal 活性分析。
RNA 质粒上的 ADE2 标记在检测 RNA 质粒丟失中是有用的。丢失 RNA 质粒的细胞几天后可变为粉色。如果阳性克隆数较少，就可不用较贵的 5-FOA，细胞就可直接于富营养培养基中培养过夜，然后铺于 SD-Leu 平板上。几天后一些克隆将变粉色或部分粉色。均一粉色的克隆即丢失了 RNA 质粒，可以再作 β-Gal 活性分析。
五、用突变和对照 RNA 确定结合的特异性
为了确定 RNA 结合的特异性，重新将编码不同杂交 RNA 的质粒导入菌株，如果阳性克隆较少，可以将不同的 RNA 质粒转化入菌株，其余一般用交配法导入质粒，可以用 R40 coat 菌株。下面是简单的交配法的操作方法。
1. 在 SD-Ura 平板上培养携带特异杂交 RNA 质粒（如突变型对野生型）的 R40coat 转化子菌落。
2. 划格法从 5-FOA 平板复制 Ura 克隆至 YPD 平板。
3. 将每个 R4coat 菌落复制至同一个 YPD 平板。
4. 于 30℃ 培养过夜进行交配。
5. 复制平板到 SD-Leu-Ura 平板上选择二倍体。
6. β-Gal 活件分析。
RNA 用于特异性分析。步骤四 “纯化 RNA 质粒再次检测” 存活的阳性克隆带有相对于细胞 RNA 优先结合杂交 RNA 的蛋白。虽然这些阳性识别杂交 RNA 的一些特点，它们不一定是与生物活性相关的因子。因此，理想的对照是精细的突变影响生物功能或以序列特好的方式影响相互作用。在一些情况下，反义诱饵可以用来做二级结构或碱基组成的对照。
真正 RNA 依赖的阳性克隆的分级。最初，阳性克隆分级生理上的相关性是不可预测的，因为蛋白的功能很多（在随机筛库时），相互作用的强度，在起始转化中用的 3-AT 的浓度，以及其他参数等。
没有微小的 RNA 突变可用怎么办？必须设计另外的方法来鉴定这些阳性克隆。很显然，功能测试是理想的，但在很多组织和系统中，这是费时又费力的。cDNA 序列可以通过直接与已知 RNA 结合蛋白或预期的分子质量（基于如 UV 交联获得）对比，获得信 息。由于毎种情况都是特异的，我们就不在这里提供通用的讨论了。然而，必须提醒的是二次筛选是很关键的。
六、鉴定阳性 cDNA
1. 从酵母细胞中提出显示出预期 RNA 结合特异性的 cDNA 质粒，转化到 E.coli 中。酵母细胞可能包含多种 cDNA 质粒，只有其中一种编码的蛋白结合 RNA。因此，应该从多个 E.coli 转化子中提取出质粒，重新转入酵母以保证获得正确的质粒。下面是一个简单的操作方法，所有的步骤都在室温进行。
(1) 牙签挑酵母单克隆至 50 μl 裂解液 [ 2% Triton X-100，1% SDS，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA ]。
(2) 加 50 μl 酚：氯仿和 0.1 g 酸洗的玻璃珠。
(3) 高速混旋 2 min。
(4) 高速离心 5 min。
(5) 转移上清至一干净的试管中，乙醇沉淀 DNA。70% 乙醇洗后干燥沉淀。
(6) 用 10 μl 水重悬沉淀。用 1 μl 电转化 E.coli。
2. 为了方便确定多少质粒在一个酵母转化子中，我们通常用裂解的酵母克隆进行 PCR 扩增，用插入片段的侧翼序列做引物。下面是酵母克隆进行 PCR 的操作方法。
(1) 用无菌枪头接触酵母克隆。
(2) 将枪头浸泡 10 μl 反应缓冲液 [ 1.2 mol/L 山梨糖醇，100 mmol/L 磷酸钠（pH 7.4)，2.5 mg/ml 酶解酶 ]，上下吹打几次，于 37℃ 孵育 5 min。
(3) 取 1 μl 进行 20 μl 体系 PCR 反应。如果需要，PCR 产物可以用色谱纯化或凝胶中纯化后直接测序。
七、功能测试或其他筛选
通常需要其他的步骤来鉴定那些阳性克隆的生物学意义。如前面（步骤五 “用突变和对照 RNA 确定结合的特异性”）所说那些筛选都是独特的，依赖于相互作用和研究的组织。用 RNA 诱饵的筛选中，鉴定出不相关的 RNA 结合蛋白是不奇怪的，而只是个合理的相互作用分子。
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