shRNA干扰载体构建

产品技术背景

pRI系列载体是基于III类RNA聚合酶启动子：人类H1启动子的专用于哺乳动物细胞RNA干扰的载体。H1启动子在哺乳动物细胞内合成类似siRNA分子的小分子RNA。由于H1启动子有精确的转录起始位点和终止信号，H1启动子转录产物精确生成人工设计的shRNA，shRNA经过RISC剪切后形成有2个U突出末端的成熟siRNA。由于H1启动子对转录产物长度的严格限制，基本上杜绝了非特异性干扰片段的产生，将载体转染细胞后对其它基因的影响降到最低。

pRI系列载体已经成功用于多种哺乳动物细胞进行基因的RNA干扰。本系列中含有新霉素抗性基因的载体用于稳定表达siRNA，可以在更长时间内对基因表达抑制后的细胞功能和生理现象进行观察和分析。

插入寡核苷酸设计

pRI系列载体的使用需要将人工设计的寡核苷酸片段插入pRI系列载体中特定的酶切位点之间，寡核苷酸片段中包含了针对目标基因的mRNA设计的长度为19nt的干扰片段。

合成时需要化学合成正向和反向两条寡核苷酸。正、反向寡核苷酸退火后与载体连接，插入载体Xho I，Bgl II位点之间，位于载体上H1启动子下游正确的位置上。连接后的载体转入哺乳动物细胞在H1启动子作用下转录产生shRNA。

1、选择干扰序列。在RNA干扰实验中，RNA干扰序列的选择会显著影响RNA干扰效果。我们建议您按照以下几点指导原则选择RNA干扰序列：

² 推荐长度为19nt，采用21nt序列也可以取得良好效果。

² RNA干扰序列中不包含大于3nt的连续相同碱基。

² RNA干扰序列的GC含量为低到中等水平（推荐GC含量在35%到50%之间）。

² 不要将RNA干扰序列设计在已知的RNA-蛋白质结合位置附近。

² 确保RNA干扰序列与其它基因没有较高的同源性。

² 方向：在编码mRNA的正义链上选择RNA干扰序列。

2、寡核苷酸设计。

（1）设计正义寡核苷酸链（5’-3’方向）。

a) 5’TCGACCC b) 19nt干扰序列正向序列（与目标mRNA一致）。 c) TTCAAGAGA（环状结构）。 d) 19nt干扰序列的反向互补序列。

e) TTTTT。

（2）设计反义寡核苷酸链（5’-3’方向）。

a) 去掉正义链寡核苷酸中5’TCGA b) 将步骤a）中得到的序列做反向互补。 c) 在步骤b）中得到的序列的5’端加上碱基GATC。

实验流程

概述：

以下为使用pRI载体的方法概述。

1、将合成的正义和反义寡核苷酸链退火。

2、用BglII和XhoI双酶切载体。

3、将退火的寡核苷酸链与酶切后的线性载体连接。

4、连接产物转化大肠杆菌。

5、转染细胞。

6、观测荧光表达（含有GFP的载体）或筛选稳定表达细胞（含有抗性的载体）。

7、检测目标基因蛋白或mRNA表达水平。

载体构建

对于实验中的很多步骤，您可以使用您实验室中常用的方法，或者您的实验经验证实有效的方法。对于酶切、DNA纯化以及转化等步骤，您可以参照《分子克隆实验指南》进行，也可以参照您购买的试剂盒中生产商提供的使用说明进行。

步骤1 ：退火寡核苷酸链

根据我们的经验，脱盐纯化的寡核苷酸足以满足连接和克隆需要。但是不同供应商提供的引物纯度差别很大，如果您连接和克隆遇到困难，可以考虑换用PAGE纯化或HPLC纯化的引物，或者使用其他供应商提供的引物。

用水将寡核苷酸稀释为100 μM。按以下体系配制退火反应体系：

正义寡核苷酸（100 μM） 5μl 反义寡核苷酸（100 μM） 5μl NaCl 100 mM Tris-Cl pH7.4 50mM

加水补足 50 μl

将配制好的退火反应缓冲液重复混合，短暂离心后放置PCR以上，运行以下程序：90℃ 4min，70℃ 10min，55℃ 10min，40℃ 10min，25℃ 10min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在-20℃长期保存。

步骤2 ：酶切载体

用XhoI和BglII双酶切2μg载体。酶切方法和体系参照您购买的内切酶说明书或者按照您的实验室习惯的方法进行。

通常情况下用大约20-30单位的酶在大约3小时可以酶切完全。

酶切后我们建议用琼脂糖凝胶回收线性化载体。将回收后的载体体积稀释为30μl。

步骤3 ：连接载体

用水将退火后寡核苷酸稀释100倍备用。按照以下体系配制连接反应体系： T4 DNA 连接酶 5U 线性化载体　　　 2μl 稀释后寡核苷酸 2 μl 10×连接酶Buffer 1μl 加水补足 10μl 接连反应条件和时间参照您购买的连接酶说明书进行。

为了减少空载体自连，连接反应完成后，在连接反应体系中加入1μl BglII，37℃反应30min，切割连接上的空载体。（选做）

步骤4 ：转化大肠杆菌感受态

用连接后产物转化大肠杆菌感受态细胞。市场上常见的大肠杆菌感受态细胞（例如Top10，DH5α）均可以使用，您也可以按照分子克隆中的方法自己制备感受态细胞。转化方法按照供应商的说明书或者您实验室中常用的方法进行。

在氨苄抗性的琼脂平板上37℃培养转化后细菌，大约14-16小时后，平板上出现单个细菌菌落。挑取多个菌落至氨苄抗性的培养基中培养后进行鉴定。

鉴定方法可以采用PCR鉴定或酶切鉴定。

PCR鉴定采用引物M13F（TGTAAAACGACGGCCAGT）和M13R-48（AGCGGATAACAATTTCACACAGGA）进行鉴定，空载体扩增产物长度为308bp，阳性克隆扩增产物为361bp。

酶切鉴定采用HindIII和EcoRI双酶切。空载体酶切产物长度为235bp，阳性克隆酶切产物长度为288bp。

鉴定正确的克隆可以用引物M13R-48测序验证插入的寡核苷酸序列是否正确无误。

步骤5 ：转染细胞

pRI系列载体可用常用的转染方法进行细胞转染。包括：磷酸钙转染、脂质体转染、电穿孔转染等。您可以购买市售的商品化转染试剂并且参照供应商说明书进行细胞转染实验。

步骤6 ：观测GFP 荧光和稳定表达细胞系筛选

如果细胞转染成功，并且您使用了带GFP的载体，根据细胞生长速度的不同，在转染后3-5天能在荧光显微镜下观察到细胞发出绿色荧光。请注意，绿色荧光蛋白的表达表明转染细胞成功，不能说明RNA干扰实验成功。

如果您使用了带有真核抗性标签如Neo-R的载体，这时您可以加入合适浓度的相应药物如G418进行稳定表达细胞株的筛选。

步骤7 ：检测RNA 干扰效率

您可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。一般情况下蛋白的表达变化与mRNA水平的表达变化一致， 也有少数情况下mRNA表达水平变化不及蛋白表达下降明显。

为检测蛋白表达情况，您可以使用Western-Blot。

为检测mRNA表达情况，您可以使用逆转录+Realtime PCR或Northern-Blot。

具体检测方法请参照分子克隆使用指南或者您实验室的常用实验方法。

疑难问题

如果RNA干扰效果不好，您需要重新检查实验步骤，看看是否有错误发生。如果一切没有问题，请考虑以下问题：

合成的寡核苷酸中错误的核苷酸较多，导致载体中连接上的寡核苷酸与您实际设计的寡核苷算不一致。做细胞转染前，最好对鉴定后的载体进行测序。如果测序没有正确的克隆，您可以考虑换一种纯化方式或者换一个供应商。

转染效率不高。要达到良好的RNA干扰效果，需要较高的转染效率配合，您可以采用带有GFP的载体对转染效率进行监测，必要时进行转染实验，试验不同的转染试剂和转染条件对转染效率的影响。

设计的干扰序列不合适。我们建议同时设计3条干扰序列同时进行试验，以便挑选出干扰效果好的序列。

您实验中可能遇到的其它问题可能与您使用的特定细胞株、目标基因以及特殊实验方法有关。您可以查阅相关文献找到解决方法，或者联系我们的技术支持tech@inovogen.com，我们的技术人员将竭诚为您服务。