RNA提取时的一些常见问题分析

一、用Trizol 抽提的RNA，用琼脂糖凝胶电泳，出现许多条带(至少四条以上)，是哪些原因导致的？

参考见解：

1、是从组织里抽的还是细胞抽的？组织的RNA电泳不理想，但目的条带仍能跑出来。细胞的电泳相当漂亮，但有时逆转录效果反而不好。组织经常出现这种情况，组织抽提的RNA不纯，而且多多少少有降解。不过下一步可以接着做逆转录，可能对后面的实验影响不会很大。

2、是mRNA的话，这样的效果挺不错的。如果是总RNA，那是降解了。不过细胞的RNA应该不容易降解，可以上样少点再跑胶。

3、可以试试在70度加热5分钟,然后再跑跑电泳可能有意想不到的结果。

4、建再进行RNA精致的过程,也就是Trizol后,加氯仿,吸取上清尽量少吸,然后将其再按规程离心一次吸取上清后加入异丙醇,然后再用70%冰乙醇洗两次可见RNA,如果还是不行的话最好用柱式吸附柱将上清与70%冰乙醇混合后过柱怀疑这种属于基因组DNA污染在操作过和的preeogress降解.所以一定要按规程进行抽提。

二、胰腺组织RNA提取时在研磨时总是粘在研钵，怎么处理？有什么好的方法吗？

参考见解：

取出胰腺组织后立刻浸入液氮中，然后将其转移至研钵中（研钵要经180度干烤4－8小时，除去RNAase），持续研磨，一边研磨一边加液氮，研磨成粉末。此时要注意液氮的补充，如果组织化开就会出现组织粘在研钵内的情况。 研磨成粉末后加入Trizol，此时，由于低温Trizol也会冻住，持续研磨至Trizol化开并澄清亮，就可以了。然后离心，进行下面的步骤。也可以使用匀浆器，很便宜，也很简单。当然要经去处RNAase处理。在冰上将组织研磨成匀浆即可。

三、所有的准备工作如干烤、DEPC浸泡等均按分子克隆上说的处理了，可是就是提取不出RNA来。异丙醇沉淀后在管底也有乳白色的东西，用DEPC水溶解却溶解不了，很粘稠。电泳什么也看不见。用的组织是小鼠的肺和脾脏，TRIZOL用的是GIBCOL的。组织和TRIZOL的比例为每50mg用1ml TRIZOL。为什么？

参考见解：

乳白色的东西有可能就是RNA,一定要溶解,实在不行就在70%乙醇洗过后迅速空气干燥一下,加DEPC水,还溶解不了就65度加热10分钟.好象100mg组织加1mlTRIZOL足够了。

四、提取酵母的总RNA都用什么方法？有好用的试剂盒吗？酵母总RNA提取应该注意什么？

参考见解：

使用热酚法抽提酵母RNA,很好用。

1、 将酵母细胞培养在3ml选择性培养基中，30℃过夜旋转培养。

2、 稀释过夜培养的菌液，重新在10ml培养基中培养细胞。

3、 ?OD600达到1.0时，收菌，4000rpm/min离心5min,弃培养基。

4、 将细胞悬浮于400μl AE缓冲液（50mM Sodium Acetate,10mM EDTA 调整pH值至5.2）。

5、 ?加入1/10体积的10% SDS，充分混合。 加入等体积在65℃预热的酸性酚（pH4.5），混合。

6、 ?65℃加热5min，冰上放置10min。在室温下8000rpm/min离心10min。

7、 ?取水相,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），10000rpm/min离心8min。

8、 取水相，加入等体积氯仿/异戊醇（49∶1）10000rpm/min离心8min。

9、 加入1/10体积3M pH5.2的醋酸钠，2.5倍体积的纯乙醇，-20℃过夜沉淀。

10、 沉淀样品于4℃离心5min，去除液体。

11、 在冰上干燥RNA（放置15min），最后用适量DEPC水溶解RNA。

五、贴壁细胞消化后可不可以离心后加入Trizol呢？有影响吗？

参考见解:

可以，用少量PBs重悬，然后用trizol提取，不过提取要快，不能存放，因为细胞为活体，表达受外界环境影响，要是已经存放了两小时，建议重做。

六、在没有液氮的条件下，直接研磨组织成粉末再加入TRizol中，对RNA提取的质量会不会影响很大？或者在研磨过程中直接加入TRizol研磨直到成粉末，这样可不可取？

参考见解：

在没有液氮的条件下，直接研磨组织成粉末再加入TRizol中，这样RNA早就没有了。

要是在研磨过程中直接加入TRizol研磨直到成粉末，可以观察组织,看研磨得什么样子了,磨的差不多时加trizol,可试一下,镜下观察然后确定加入trizol试剂。

七、冻存细胞与新鲜细胞的RNA提取有区别吗？具体该怎么操作？

参考见解：

新鲜细胞与冻存细胞RNA提取没什么区别。千万不能等细胞溶解了存状态把Trizol直接加到冻存管了，一起化开，振荡振荡就可以了。与从组织中提RNA 差不多。

八、做软骨组织的RNA提取，应当怎样开始试验？

参考见解：

1、 按RNA提取的要求处理研钵。

2、 研钵中加入液氮。

3、 将软骨组织放入盛有液氮的研钵内。

4、 研碎软骨，液氮蒸发完时加入适量的Trizol。

5、 待Trizol试剂恢复液态后吸入EP管中。

6、 然后按常规方法提取RNA。

九、黄曲霉rna提取（trizol法），加完异丙醇沉淀后得到的是接近透明的沉淀，加75％酒精洗涤后，加depc水能溶解，电泳后跑不出来带，有的点样孔很亮，是怎么回事？另外，是不是rna即使降解了也能跑出smear带？

参考见解：

1、 可能是菌体量过大导致Trizol量严重不足，一般为100mg/1 ml Trizol。

2、 存在操作过程中蛋白质残留过多的现象是点样口很亮，用氯仿抽提时，尽量不要吸到蛋白层，为保证RNA 的质量，水层可以稍稍多留点；照片说明RNA在 提取过程中降解了，出现了一片Smear。

3、 导致RNA 降解的原因很多，过滤后的菌体用Pbs清洗后是不是用离心的方法收集的菌体。PBS洗涤后有没有把PBS完全吸尽；没吸尽的话可能导致trizol不能完全把菌体中的RNA酶抑制住从而导致RNA被完全降解。

4、 液氮研磨的时间并不重要，最好是快速而充分的研磨才是最必要的，而且中途不能让其解冻。觉得可以了就马上加trizol 一直研磨直至其变得像润肤霜就可以继续下面步骤了重要的是菌体量和 Trizol加的量有多大，如果Trizol加量相对少，就不能很好的裂解组织和细胞，同时也不能很好的保护RNA,RNA会被RNAase降解掉，所以可以适当增加Trizol的量。

5、 再有操作过程是否规范，最好都是用过滤嘴枪头，最好都是经过depc处理tip and tube 使用一次的橡胶手套，全程带口罩等等细节。至于电泳的问题只要是RNA专用的电泳槽， 电泳槽的问题不大，最主要是在提取的过程中RNA降解了。

十、提肝的RNA,效果很好,但提脑和卵巢却提不出来,都是同期采的样,不知道问题出在那里?

参考见解：

1、 使用组织提取RNA时组织必须新鲜,时间一长RNA便容易被内源性的RNA酶降解,即使把组织放在-80也阻止不了RNA酶的作用.如果用trizol提的话应该趁组织新鲜时先进行匀浆,再把匀浆液放于-80冻存.因为trizol本身含有酚,对RNA有一定的保护作用.

2、 DNA和RNA 的含量都是非常高的,脑卵巢中要少.注意RNase.最后溶解RNA加的DEPC处理水不要太多.在提取的过程中也要注意外源性RNA酶的降解，如果用trizol法的话，一般先降trizol加到研磨器中再加入组织研磨，整个过程中都要带手套，所有材料最好都要用DEPC水浸泡以后再高压。