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核酸分子液相杂交实验（通过RNA酶保护分析法进行液相杂交）

2024-06-13 RNA 加入收藏

简介RNA 酶保护分析法（RNase protection assay， RPA）的原理与核酸酶 S1 保护分析法基本相同，只是所采用的探针为单链 RNA 探针

简介

RNA 酶保护分析法（RNase protection assay， RPA）的原理与核酸酶 S1 保护分析法基本相同，只是所采用的探针为单链 RNA 探针，杂交后形成 RNA／RNA 双链。RNA 酶 A 和 RNA 酶 T1 专一性降解单链 RNA，而双链 RNA 则不被降解。此法的灵敏度较核酸酶 S1 保护分析法还要高出数倍，可用于 RNA 定量、RNA 末端定位及确定内含子在相应基因中的位置。

原理

RNA酶保护分析法的基本原理是利用单链 RNA 探针，与待测的 RNA样品进行杂交形成 RNA:RNA 双链分子，由于 RNA 酶可专一性地降解未杂交的单链 RNA，而双链受到保护不被降解，经凝胶电泳可以确定目的 RNA 的长度。

用途

RNA 酶保护分析法可用于 RNA 定量、RNA 末端定位及确定内含子在相应基因中的位置。

材料与仪器

试剂：

1. GACU POOL：取100 mMATP、CTP、GTP各2.78 μl、100 mM UTP 0.06 μl，加 DEPC H2O 至100 μl。

2. 杂交缓冲液

IPES 0.134 g、0.5 M EDTA（pH8.0）20 μl、5 M NaCl 0.8 ml、甲酰胺 8 ml，加 DEPC H2O 至 10 ml。

3. RNase 消化液：5 M NaCl 120 μl、1 M Tris-HCl（pH7.4） 20 μl、0.5 M EDTA（pH 8.0）20 μl、RNase A（10 mg/ml） 8 μl、RNase T1（250 U/μl） 1μl，加DEPC H2O 至 2 ml。

仪器：

离心机、水浴锅、电泳仪、

步骤

RNA 酶保护分析法的基本过程可分为如下几步：

1.反义 RNA 可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的 PCR 产物为模板制备，本文介绍后者：

（1）设计含 T7 启动子的 PCR 引物：由于 PCR 产物将作为合成反义 RNA 的模板，所以一对引物中的下游引物 5’-端要含 T7 启动子序列：

T7 启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR 产物的长度决定了反义 RNA 探针的长度，具体设计时可考虑 100-400bp 长。最好采用巢式 PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性。

（2）PCR：先用上游引物和下游引物Ⅰ进行 PCR，再以 PCR 产物为模板，用上游引物和下游引物 Ⅱ-T7进行二次 PCR。

（3）探针合成标记与纯化：在 0.5ml 离心管中加入下列试剂：

RNasin （40 U/μl） 0.5 μl、GACU POOL GAC、DTT （二硫苏糖醇，0.1 M） 1 μl、5×转录 buffer 2 μl、模板（50 ng/μl） 1 μl、T7 RNA 聚合酶（15 U） 1 μl，混合后，短暂离心，37℃ 保温 1h。

加入 DNaseⅠ（10 U/μl）1 μl， 37℃ 15 min，然后 75 ℃ 10 min 以灭活 DNAseⅠ和 T7 RNA 聚合酶。加入：饱和酚 50 μl/、氯仿 50 μl、酵母 tRNA（2 μg/μl）4 μl、DEPC H2O 100 μl，室温下充分混匀，离心 10 000 g×2 min。