微量RNA的抽提RNeasy MinElute Spin Column（QIAGEN）

抽提微量RNA的柱子最大可以吸附45ug 的RNA。 ·为了更好地裂解，细胞数不能大于5×105，细胞过多会减低产率和纯度。 准备工作： 1.在 24 ml 96－100％乙醇 中加入 6 ml 去RNA酶的水。 2.在每 1 ml Buffer RLT 中加入10 ml β-ME (加入β-ME的Buffer RLT可在室温下放置1月)。 3. Buffer RPE中加入4倍体积的96－100％乙醇。 4.在 550 ml 的去RNA酶的水中加入1500 Kunitz单位的DNA酶1，轻轻翻转试管混匀，勿振荡（溶好的DNA酶1分装后，－20℃可放置9个月，2－8℃可放置6周） 5.当细胞数少于5000个，须在匀浆前在溶液中加入载体 RNA。 首次用时，在1ml 去RNA酶的水中加入 310 ug 载体RNA，则载体RNA的浓度为310 ug/ul，置－20℃保存。 实验时所需浓度为4ng/ul，配制如下：取5 ul 浓度为310 ug/ul的载体RNA，加入34 ul Buffer RLT，吹打混匀，再取 6 ul 稀释液加入54 ul Buffer RLT，得终浓度4 ng/ ul，加5ul到第3步的溶液中。 微量RNA的抽提 步骤： 1.收集细胞：300×g离心5 min（ 离心管 自备），沉淀细胞，仔细吸去上清液。 2.加入Buffer RLT分散细胞。轻敲 试管 将沉淀弄分散，加入350 ul Buffer RLT振荡或吹打混匀， ·当细胞少于1×10 5 ，Buffer RLT可用75ul （可用小管），振荡1 min 混匀，接第4步。 3.匀浆细胞： 细胞数少于5000个时，加20 ng 载体RNA ( 4ng/ul 溶液 5 ul)，到溶解液中。 3a 在柱子中加入溶解液，置于2ml收集管中，以最大速度离心2min； 4.加入1倍体积的（约350 ul）70％乙醇 到匀浆的液体中，吹打混匀（勿离心）， ·若匀浆的液体有所丢失，相应地减少70％乙醇的量， ·若第2步中用了75ul的Buffer RLT，则只用75 ul 70％乙醇。 5.将样本（包括可能形成的沉淀）加入到柱子中（柱子放在一个2ml的收集管中），轻轻盖上管盖， 8000×g ( or 10000rpm)离心15s，弃掉过滤到收集管中的液体。收集管继续用 6.加入350 ul的Buffer RW1 到柱子中，轻轻盖上管盖，8000×g（or 10000rpm）离心15s洗柱子，弃掉收集管中的液体，接第8步。 7.在70 ul Buffer RDD中加入 10 ul DNase 1溶液，轻轻翻转 试管 混匀。（勿振荡） 8.吸起上述 80ul 混合液加入柱子中的硅胶薄膜上，室温放置15min。（勿加到管壁上） 9 吸350ul Buffer RW1 到柱子中， 8000×g（or 10000rpm）离心15s，弃掉收集管及收集管中的液体。 10.将柱子转到1个新的2ml 收集管中，加500 ul Buffer RPE 到柱子中，轻轻盖上 试管 8000×g（or 10000rpm）离心15s洗柱子，弃掉收集管中的液体，收集管再用。 11.加500 ul 80％乙醇 到柱子中，轻轻盖上管盖，8000×g（or 10000rpm）离心2 min 以使硅胶薄膜干燥，弃掉收集管及收集管中的液体。（柱子不要碰到收集管中的液体） 12.将柱子转入1个新的2ml 管中，打开盖子，以最大速度离心5min，弃掉收集管和管中的液体。 13.将柱子转入1个新的1.5ml 的EP管中，加14 ul 去RNA酶的水到硅胶薄膜上，轻轻盖上盖子，以最大速度离心1min，将所得RNA溶液做逆转录或保存。