组织和细胞RNA的制备：异硫氰酸胍法

（一）试剂准备

1. CSB缓冲液：42mM柠檬酸钠；0.83% N-lauryl sarcosine（十二烷基，N甲基甘氨酸钠）；0.2 mM β-巯基乙醇。

2. 变性液：异硫氰酸胍（终浓度 4 M）25g、CSB缓冲液 33ml,混合直至完全溶解，可在65℃助溶。4℃保存备用。

3. 2 M乙酸钠：pH 4.0。

4. 异丙醇

5. 无水乙醇、70%乙醇

6. 酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）

7. DEPC H2O:100ml ddH2O中，加入DEPC 0.1ml,弃分振荡，37℃孵育过夜。15磅高压灭茵，4℃保存备用。

（二）操作步骤

1. 样品处理：

（1）培养细胞：收集细胞1-2×107，离心，500g×5min。对于贴壁培养细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重悬细胞并转移至10ml离心管中；悬浮培养细胞可直接转移离心管；离心：500g×5min；PBS洗涤2次。弃上清，置冰浴。加预冷变性液2 ml，充分摇动，使细胞裂解完全。以下操作均在冰浴中进行。

（2）组织：取1-2g组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置组织匀浆器中，加入预冷的变性液12ml，在冰浴中充分匀浆。

2. 加2 M乙酸钠（pH 4.0）0.2ml，混合后将溶液转移至5ml离心管中。

3. 加酚：氯仿：异戊醇2.2ml，颠倒混合用力振荡10s，冰上放置10min。

4. 4℃离心，12000g×20min。

5. 小心吸取上层含有RNA的水相，并转移至一新的5ml离心管中。避免吸取两相之间的蛋白物质。

6. 加等体积的异丙醇，置-20℃至少30min，沉淀RNA。

7. 4℃离心，12000g×15min。

8. 弃上清，再加变性液2ml重悬RNA沉淀物，振荡直至RNA完全溶解（必要时可65℃水浴促溶）。

9. 加入等体积异丙醇，置-20℃ 30min。

10. 4℃离心，12000g×15min。

11. 弃上清，加入70%乙醇4ml洗涤RNA沉淀。4℃离心，8000g×5min。

12. 弃上清，将沉淀晾干。

13. 加入适量DEPC H2O溶液解RNA（65℃促溶10-15min）。

（三）注意事项：

1. 所有实验过程均须避免Rnase的污染。

2. 要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。