RNA原位核酸杂交方法

一、基本原理 是指运用寡核苷酸等探针检测细胞和组织的RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知RNA核苷酸片段，近核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的Mrna、rRNA 和tRNA分子。 RNA原位杂交不同于DNA原位杂交主要有： （1）使用的探针不同：RNA原位杂交中多采用RNA或寡核苷酸探针，特异性更强。 （2）检测的目的不同：RNA原位杂交检测和分析的主要为内源性基因，包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因。DNA原位杂交主要为外源性基因检测。 （3）有较高的灵敏度：在检出细胞和组织内在低拷贝核苷酸时，RNA原位杂交能获得较好定位。   二、RNA原位杂交中的探针 1.  探针的种类 RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。根据在RNA杂交中所使用的探针依其来源可分为三种：即特异性cDNA、cRNA探针和人工合成寡核苷酸探针。 2.  探针的标记 根据标记物可分为同位素标记和非同位素标记。非同位素标记技术目前有生物素，地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和荧光素。   三、地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交 组织的前处理： 1.  冰冻切片的制备：离体后组织立即取材，1.5 cm×1.2 cm×0.2 cm，放入4%多聚甲醛溶液中（PBS新配制），4℃，固定2-4 h。倒去固定液后，加入30%蔗糖溶液（PBS新配制），4℃过夜，次日将组织切片，或储存在-80℃或-140℃超低温冰箱内。 2.  组织的固定和石蜡切片的制备：离体后组织立即取材，1.5 cm×1.2 cm×0.2 cm，放入4%多聚甲醛溶液内（PBS新配制），也可用2.5%戊二醛，在室温下固定3-4 h。用PBS冲洗，经梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片 操作步骤： （1） 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次5分钟； （2） 无水乙醇浸泡2次，每次1分钟； （3） 95%乙醇浸泡2次，每次1分钟； （4） PBS清洗3分钟； （5） 2%焦碳酸二乙酯（DEPC）室温下浸泡10分钟； （6） PBS清洗10分钟； （7） 滴加不含RNA酶的1 ug/ml 蛋白酶K，37℃孵育15-20分钟； （8） PBS清洗2次，每次3分钟； （9） 0.2 N 的HCl 30分钟； （10）PBS清洗2次，每次3分钟； （11）酸酐处理液振荡洗2次，每次5分钟； （12）PBS清洗2次，每次5分钟； （13）预杂交缓冲液漂洗30分钟； （14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟， 置于冰块中10分钟； （15）杂交37-42℃过夜。 （16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片； （17）PBS清洗3分钟； （18）含RNA酶A的NTE缓冲液37℃漂洗30分钟； （19）PBS清洗5分钟； （20）室温，2×SSC漂洗10分钟； （21）37℃，1×SSC漂洗10分钟； （22）37℃，0.5×SSC漂洗10分钟； （23）37℃，Buffer A漂洗10分钟； （24）加入抗地高辛抗体37℃孵育3 小时； （25）Buffer A漂洗2次，每次10分钟； （26）Buffer B漂洗2次，每次5分钟； （27）NBT/BCIP显色，显微镜下进行观察。 （28）水洗； （29）核固红复染，脱水封片。   试剂配制： （1）0.2 mol/L HCl：HCl 8.2 ml，ddH2O，定容0.5 L （2）0.1 mol/L 三乙醇胺(pH8.0)：三乙醇胺 5.33 ml，ddH2O定容0.4 L。 （3）酸酐处理液: 0.25%醋酸酐（临用前用0.1 mol/L 三乙醇胺(pH8.0)配）。 （4）20×SSC(pH7.0)：NaCl 175.3 g，枸橼酸钠 88.2 g，ddH2O 定容1 L。 （5）100×Denhardt's：Ficoll 1 g，PVP 1 g，BSA 1 g，ddH2O 定容50 ml。 （6）杂交液：Formamide 5 ml，20×SSC 2.5 ml，Dextran sulfate 1 g，100×Denhardt's 0.5 ml，10%SDS 0.5 ml，10 g/L sperm DNA 0.1 ml，H2O 1.4 L。 （7）Buffer A（pH7.5）：100 mmol/L Tris-HCl， 150 mmol/L NaCl （8）Buffer B （pH9.5）：100 mmol/L Tris-HCl， 100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2。 （9）Buffer C（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA。 （10）NTE缓冲液：500 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA pH8.0 （11） 预杂交缓冲液：含50%去离子甲酰胺的4×SSC （12）NBT/BCIP液：（NBT：氯化氮四唑蓝，BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐） A、将10 mg NBT溶于200 ml 二甲基甲酰胺中。 B、于37℃加入1ml底物缓冲液（50 mmol/L Tris HCl PH=9.5，100 mmol/L NaCl 1 mmol/L MgCl2后，滴入）。 C、将5 mg BCIP溶于200 ml 二甲基甲酰胺中，然后慢慢加入上述溶液中，置-20℃保存。