细胞因子的分子生物学检测法

细胞因子基因的检测包括对其DNA的检测和mRNA表达水平的检测。特定细胞因子mRNA表达水平的检测有助于判断细胞表达该细胞因子的水平；而细胞因子DNA的检测可以判断该细胞因子基因存在与否及其变异情况。常用的方法有Southern印迹、斑点印迹、PCR，原位杂交及原位PCR等，Northern印迹及RT-PCR。这里简要介绍常见细胞因子mRNA表达水平的检测。

一、斑点杂交法测定培养细胞IL-2 mRNA的含量

本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析。该法先将RNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上，可用手工操作点样，也可用斑点式点样器点样，再与特异性探针进行杂交。

由于其操作比Northern印迹简单、迅速、所需样品量少，且可在同一张膜上同时进行多个样品的检测，故很适合于临床应用。亦可用于DNA的检测。但其缺点是不能鉴定所测基因的分子量。

下面以检测培养细胞的IL-2 mRNA含量的检测，说明斑点杂交法的操作过程。只要改变相应的DNA探针，此方法也适用与其他细胞因子mRNA含量的检测；或者改变RNA的提取方法，也适用于其他类型细胞的检测。

二、原位杂交法测定TNF的mRNA

RNA-DNA原位杂交的原理与分子杂交其它方法的原理相同。但是其它方法都是将RNA提取出来后进行分子杂交，而原位杂交则是在细胞内mRNA原有位置上进行杂交，细胞则尽可能保持原有形态。

将细胞以适当方法固定后，除去脂类并适当消化细胞内的蛋白质，增大细胞对大分子物质的通透性，使DNA探针便于出入细胞。与免疫组化相结合，原位杂交可以将显微镜下的组织形态学资料与DNA，mRNA，蛋白质水平的基因活动联系起来。进行分子杂交之后，将玻片上细胞置与显微镜下观察，可确定不同细胞内的基因表达定位情况。

三、反转录PCR(RT-PCR)定量检测细胞因子的mRNA

细胞因子的mRNA寿命短且拷贝数低，因此难以在小量样本中进行检测。RT-PCR是一种能检测细胞内低丰度特异RNA的方法，其原理是首先以RNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成与RNA互补的cDNA。

然后以cDNA为模板，用PCR技术对靶序列进行扩增，使微量细胞因子的RNA经放大后检出。RT-PCR能检出单个细胞中少于10个拷贝的特异RNA，如同时放大内参照物，即可对RT-PCR检出的细胞因子mRNA进行定量。