动植物组织mRNA提取实验方法

一、材料 水稻叶片或小鼠肝组织。 二、设备 研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。 三、试剂   1.  无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。   2.  75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。   3.  1×层析柱加样缓冲液；20 mmol/L Tris-HCl（pH7.6），0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA（pH8.0），0.1% SDS。   4.  洗脱缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH7.6），1 mmol/L EDTA（pH8.0），0.05% SDS。 四、操作步骤   （一）动植物总RNA提取-Trizol法 Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。   1.  将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100 mg组织加入1 ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。   2.  研磨液室温放置5分钟，然后以每1 mlTrizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。   3.  取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000 g离心10分钟。   4.  弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1 ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4 ℃下7500 g离心5分钟。   5.  小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55 ℃-60 ℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70 ℃。 [注意] 1.  整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。   2.  加氯仿前的匀浆液可在-70 ℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4 ℃保存一周，-20 ℃保存一年。   （二）mRNA提取 由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。   1.  用0.1 mol/L NaOH悬浮0.5-1.0 g oligo(dT)纤维素。   2.  将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0 ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。   3.  用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。   4.  将（一）中提取的RNA液于65 ℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。   5.  测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。   6.  测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。   7.  加入1/10体积的3 M NaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -20 ℃30分钟。   8.  4 ℃下12000 g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4 ℃下12000 g离心5分钟。   9.  小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。   10.  用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70 ℃）。 [注意] 1.  mRNA在70%乙醇中-70 ℃可保存一年以上。   2.  oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3 mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。