RNA的制备

来源于任何细胞的RNA都可以通过反转录酶的作用拷贝成双链DNA并克隆化，获得相应的于特定细胞来源的cDNA文库。因此，RNA制备的意义有两个方面 * 获得特定细胞来源的cDNA文库，克隆目的基因 * 分析基因的表达，阐明基因调控的特性，了解从基因转录产生RNA的结构，数量，水平及合成的速率 抑制RNA酶活性的方法 1. 灭菌法：将RNA提取过程中的使用的器具进行高温灭菌处理（180 ºC，8h），溶液等在高压下蒸汽灭菌15min（1.034 X 105 Pa) 2. 焦碳酸二乙酯（DEPC）抑制法：DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，塑料或玻璃器皿在含0.1%的DEPC溶液中浸泡2h，然后以灭菌水淋洗数次，在100 ºC下干烤15min。 3. RNA酶抑制剂法：利用RNA酶蛋白质抑制剂与RNA酶紧密结合防止其发挥酶活作用；利用氧钒核糖核苷复合物与RNA酶结合；利用硅藻土吸附RNA酶。 一、细菌RNA的制备 1．菌体培养 同上 2. 离心收集菌体菌体 经离心（5000g，5min）后，悬浮于终止缓冲液中（200mM Tris-HCl，pH8.0; 20 mM EDTA; 20 mM Na2N3; 20 mM 金精三羧酸(ATA)） 3. 菌体裂解 加入STET缓冲液(8% 蔗糖; 5% Triton X-100; 50mM EDTA; 50mM Tris-HCl pH 7.0)悬浮加入0.2 M 的VRC (0.2M和10 mM的氧钒核苷复合物) 4. RNA提取 加入0.5 V的苯酚振荡1 min,0.5 V氯仿振荡1 min,10 000 g, 10 min,水相加入1/10 V的NaAc, 2 V的无水乙醇10000 g, 10 min沉淀溶于0,2 M 的VRC,以酚-氯仿抽提两次 5. RNA纯化 重溶沉淀于DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水中,加入CsCl溶液,于室温离心(200000 g,1 h)回收RNA沉淀,溶于DEPC处理的水中,加入1/10 V的3 M的NaAc, 2 V的乙醇,离心后 6．RNA的溶解 将RNA沉淀溶于水中 二、植物组织细胞RNA的制备 1.细胞处理: 将植物组织置于液氮中冻结，研成粉末，加入匀浆缓冲液，高速匀浆，后高速离心（20000g，10 min） 2.RNA提取:上清液中加入皂土(4%),等体积的酚,低温振荡5min，200000 g, 10 min 3.重复该步骤一次 4.RNA沉淀: 于上清液中加入KAc至终浓度为0.2 M,加两倍体积 的无水乙醇,于0oC 30 min，30000g,20 min 5．RNA的溶解：沉淀溶于水中或TE缓冲液 三、哺乳动物细胞质RNA的制备 1． 细胞培养 : 人工组织培养 2．细胞裂解：以含磷酸缓冲液（PBS）的生理盐水洗细胞悬浮于预冷的溶胞缓冲液中，加入24%的蔗糖，1%的NP-40溶胞缓冲液 3．去蛋白： 加入Protease K，于37 ºC温育30 min，酚抽提 4．去DNA：乙醇沉淀,悬浮于DNA消化液(DNase I, 0.2% SDS) 5. 沉淀RNA: 加入终浓度为0.3 M的NaAc, 2V 无水乙醇于-20 ºC 2 h, 离心收集RNA. 四、mRNA的分离提纯—寡聚(dT)-纤维素柱法 上柱缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl (pH7.6) 0.5 mol/L NaCl 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 0.1% 十二烷基肌氨酸钠 洗脱缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 0.05% SDS 寡聚(dT)-纤维素柱法提纯mRNA的过程