RNAi技术初探

RNA干扰(RNA interference， RNAi)是近年来发现的研究 生物 体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，它利用了由小干扰RNA(small interfering RNA， siRNA)引起的 生物 细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。RNAi是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。它普遍存在于各种生物，具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达ｍRNA的生物学功能。RNA干扰现象不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。 1 RNAi的历史背景 20世纪20年代，人们发现，植物受到野生型病毒感染后，能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力。而真正发现双链RNA(dsRNA)能引起基因沉默现象，则在1995年。当时，Guo和Kemphues用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中parl基因的表达时发现反义RNA具有抑制该基因表达的功能，同时正义RNA也同样出现了类似的抑制效应，实验表明正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达，而且两者的作用是相互独立的，机制也各不相同。1998年，Fire和Mello等人首次发现dsRNA能够特异地抑制C.elegans中的纹状肌细胞unc-22基因的表达，结果发现dsRNA所引起的基因沉默效应要比单单应用反义RNA或正义RNA强十几倍。而且注射入C.elegans的性腺后，在其第一子代中也诱导出了同样基因的抑制现象，说明在原核生物中，RNAi具有可遗传性。他们将这一现象称为RNAi。因为RNAi作用发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(PTGS)或共抑制。 此后，又在果蝇、锥虫、涡虫、无脊椎动物、脊椎动物、植物、真菌、斑马鱼及哺乳动物等真核生物中发现了RNAi现象。不同领域中的发现促使人们思考它们之间的可能联系。RNAi在果蝇中得到证实的同时，发现转座子翻转移位可启动RNAi，而转座子翻转移位所造成的同源基因沉默很似植物中的共抑制；在线饱霉实验中，发现PTGS过程中所必须的蛋白QDE1与RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)同源，提示PTGS过程中可能涉及到RNA复制及调节作用。同样在植物韧皮部注射dsRNA可遍及扩散到整个植株体产生RNAi；更有趣的是，把线虫浸润到含有dsRNA液体中或喂养表达dsRNA的工程菌也可以诱发RNAi。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。 2 RNAi的作用机理 目前对RNAi的作用机理尚不清楚， RNAi是由dsRNA诱导的多步骤、多因素参与的过程，属于基因转录后调控，其中需要ATP的参与。通常认为dsRNA由核酸内切酶(RNA se Ⅲ)切割成21～23bp的siRNA (在果蝇RNA se Ⅲ 被称为 dicer)，siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、螺旋酶)结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC，然后RISC再特异性地与ｍRNA的同源区结合，通过酶的作用使ｍRNA降解，而产生基因沉默。靶ｍRNA被破坏后， RISC还可以再作用于其它靶分子。siRNA还具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白 激酶 (PKP)的激活而使其被降解，从而大大减少了其对ｍRNA的抑制作用。 3 RNAi的特点 RNAi被美国科学杂志评为2001年十大科技突破之一，科学家对RNA干扰现象之所以表现出极大关注在于RNA干扰在基因功能和相关方面的研究中具有许多传统方法无法比拟的特点和优势。RNAi有7个重要特征 3.1 RNAi是dsRNA介导的PTGS机制 在此过程中，注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应。翻译抑制剂对RNAi不产生影响。 3.2高特异性 RNAi只能特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，而其他mRNA的表达则不受影响。 3.3高效性 无论是在体内还是体外实验中，仅需少量的dsRNA(几个数量级浓度)就能有效的抑制靶基因表达，抑制的效率在低等动物中>90%。这表明dsRNA介导的RNA干扰是一个以催化放大的方式进行的。 3.4 dsRNA长度限制性 引发有效iRNA的dsRNA需要一个最小的长度。dsRNA小片段如小于21～23nt(如10～15nt)，特异性将显著降低，不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21～23nt，互补序列可能延伸，超出抑制范围。 3.5 RNAi有浓度、时间双重依赖性 dsRNA诱发的RNAi效应的强度随着其浓度的增高而增强。高浓度的dsRNA产生较多的siRNA，不仅能增强反应体系的效应，而且还能抵消ADARs(RNA依赖的腺苷 脱氨酶 )的作用。实验表明，RNAi在哺乳动物细胞中只能维持一段时间，干扰效应通常出现在注射dsRNA 6h后，可持续72h以上。