[核酸抽提]mRNA的分离技巧

mRNA的分离

与rRNA和tRNA不同的是，哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3"端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972）。在构建cDNA文库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。 进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时，与总RNA相比，采用poly(A)+ RNA能获得更为满意的结果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制备Oligo(dT)－纤维素，也可以买现成的产品。 1）用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纤维素。 2）将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为1m的oligo(dT)－纤维素最大量为10mg总RNA，如果总RNA的量较少，则应减少oligo(dT)－纤维素的使用量以防止poly(A)+RNA在过柱以及后续步骤中损失。 3）用无菌的1x层析柱加样缓冲液冲洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x层析柱加样缓冲液 20mmol/L Tris.Cl(pH7.6) 0.5mol/L NaCl 1mmol/L EDTA(pH8.0) 0.1％SDS 可按以下方法制备灭菌的层析柱加样缓冲液；将适量无RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化钠和EDTA贮存液混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高压下蒸气灭菌，待其次序却至65℃左右时加入已在65℃预热30分钟的10 ％SDS贮存液。也可以用0.05mol/L柠檬酸钠代替Tris.Cl 然后用DEPC处理柠檬钠－NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。 4）用灭菌水溶解RNA，于65℃温育5分钟后使迅速冷却至室温，加等体积的2x层析柱加样缓冲液，上样，立即用灭菌的试管收集洗液。 当所的RNA溶液均进入柱床后，加1倍体积的1x层析柱加样 ，继续收集洗出液。加热RNA可以破坏可能涉及poly(A)尾的二级结构。 5）当全部溶液流出后，将收集液置于65℃温育5分钟，重新上样，并收集流出液。 6）用5-10倍柱床体积的1x层析柱加样缓冲液洗柱，分部收集洗出液，测定每一收集管的OD260。最补由于不带poly)A)的RNA洗过柱床， OD260会很高，后来OD260值则很小或为零。在某些方案中，上述步骤后还用5倍柱术体积的含0.1mol/L NaCl的1x 层析柱加样缓冲液洗柱床，然而由于洗出的不带poly(A)的RNA很少甚至没有， 因此这一步骤可以省略。 7）用2－3倍柱床体积的经灭菌且无RNA酶的洗脱缓冲液洗脱mRNA，以1/3－1/2柱床体积分部收集洗脱液。洗脱缓冲液 10mmol/L Tris.Cl(pH7.6) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 0.05％SDS 用于配制洗脱缓冲液的Tris. Cl 和EDTA贮存液应为新近高压的溶液 可用适量的灭菌水稀释上述贮存液配制洗脱缓冲液。洗脱缓冲液不能高压处理，因高压会使溶产生大量气泡。 8）收集液置于透明的小溶器内，测定OD260， 使用前比色杯须用浓盐酸：甲醇（1：1）浸泡1小时，再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗合并含有RNA的洗脱组分。经上述一轮oligo(dT)－纤维素亲和量层析后得到的RNA中，带与不带poly(A)的RNA，其含量近乎相等。如欲进一步纯化mRNA，可将洗脱液于65 ℃温育3分钟，迅速冷却至室温，加入NaCl至终浓度为0.5mol/L，用同一oligo(dT)纤维素柱进行第二轮层析。 9）收集oligo(dT)－纤维素柱层析的洗脱液，在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸钠（pH5.2）至终深度为0.3mol/L并混匀。加2.5 倍体积用冰预冷的乙醇，混匀，冰浴至少30分钟。 10）于4℃以10 000g离心15分钟回收poly(A)+RNA，小心弃去上清液，用70 ％乙醇洗涤沉淀（通常看不见沉淀），离心片刻，在空气中晾干核酸沉淀。 11）用少量水重溶RNA，置于比色杯内，测定OD260， 使用前比色杯须用浓盐酸：甲醇（1：1）浸泡1小时，再用经DEPC处理并高压处理过的水彻底冲洗。 12）将mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯 离心管 内，加3倍体积乙醇， 混匀，于－70℃保存备用。回收RNA时，只需取出一小份贮存液，加3mol/K乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L， 混匀，用微量 离心机 于4℃以12 000g离心5分钟即可。 i.OD260＝1的溶液其RNA含量约为40μg/ml. ii.从107个哺乳动物培养细胞中可获得1－5μg mRNA，所得mRNA通常只占上柱的总RNA的1－2％。