cDNA合成技术

Promega公司的RibocloneR M-MLV(H -) cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶，使合成的cDNA更长。该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶，cDNA第二链合成采用置换合成法，采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成，最后用T4 DNA聚合酶切去单链末端，方法简便易行。该系统试剂包括：

　　20μg 特异性引物

　　200μl M-MLV第一链缓冲液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃时)； 375mmol/l KCl；

　　15mmol/L MgCl2； 50mmol/L DTT； 10mmol/L dATP， dCTP， dGTP， dTTP混合物(各2.5mmol/L)

　　2×625μ rRNasinR RNA酶抑制剂

　　10，000μ M-MLV反转录酶， RNase H-

　　5μg 对照RNA

　　400μl M-MLV第二链缓冲液(10×)，配方如下：

　　400mmol/L Tris·Cl ，pH7.2； 850mmol/L KCl； 44mmol/L MgCl2；

　　30mmol/L DTT； 0.5mg/ml BSA。

　　500μ RNase H

　　500μ DNA聚合酶Ⅰ

　　100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ

　　2×1.25ml 不含核酸酶的水

　　以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40μg mRNA。

　　（一） 第一链合成

　　1. 试剂

　　[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM和200mM)，TE-饱和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE缓冲液。

　　2. 操作步骤

　　(1) 取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管，加入RNA模板和适当引物，每μg RNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接头，使用0.3μg)，用H2 O调整体积至15μl， 70℃处理5分钟，冷却至室温，离心使溶液集中在管底，再依次加入。

　　5×第一链缓冲液 5μl

　　rRNasin RNA酶抑制剂 25U

　　M-MLV(H -)反转录酶 200U

　　H2O调至总体积25μl

　　(2) 用手指轻弹管壁，吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，用以第一链同位素掺入放射性活性测定。

　　(3) 37℃(随机引物)或42℃(其它引物)温浴1小时

　　(4) 取出置于冰上

　　(5) 掺入测定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA终止反应，并使总体积为100μl。可取90μl进行电泳分析(先用苯酚抽提)，另10μl进行同位素掺入放射性活性测定。

　　(6) 第一链合成eppendorf管可直接用于第二链合成

　　注：以上25μl反应总体积中所用RNA量为1μg，如合成5μg RNA，则可按比例扩大反应体积， 倒5μg RNA使用125μl总体积进行合成。