细胞组分的分析方法――核酸序列的原位杂交

一.基本原理

　　核酸分子杂交技术是目前分子生生物学、细胞生物学和生物化学研究中应用最广泛的技术之一，是定性、定量和定位检测两条来源不同的聚核苷酸链上碱基顺序同源性的一种手段。DNA分子是高度有序的双键分子。一条链的碱基与另一条链的碱基以氢键配对相连．形成腺嘌呤与胸腺嘧啶(A．T)，鸟嘌呤与胞嘧啶（G.C）的特定碱基对；在RNA中则为A与U(尿嘧啶)，G与C配对。

　　在碱性环境加热或加入变性剂的条件下，核酸分子双链之间的氢键被破坏，解链成两条单链(称为变性)。此时如果加入已知DNA和RNA片段（称为探针)，在一定的离子强度和温度下，两条具有互补碱基顺序的DNA与相应的cDNA或RNA，RNA与相应的RNA或cDNA均可形成双链分子结构(称为复性)，这种由互补碱基顺序的任何单链核酸分子片段形成双链的过程称为分子杂交(Molecular hybridization)。

　　核酸分子杂交可分为液相杂交、固相杂交和原位杂交等三种类型。

　　原位杂交(Hybridization in situ)即原位核酸分子杂交。此法最早(1969)用于细胞内核糖体RNA的定位等研究，现在被广泛用来进行细胞内特殊核酸序列的定性、定位和定量的研究，被称为原位杂交组织化学或原位杂交细胞化学(In situ hybridization cytoehemistry)。它是将重组DNA技术与组织细胞化学技术相结合，在细胞原位显示某种特定基因，mRNA及其产物(特异蛋白)的表达、定位、半定量和变化规律的一种新技术。cDNA的制备因所显示的mRNA的不同而各异，必须借助于重组DNA技术。mRNA在RNA依赖性DNA聚合酶的作用下，可反转录产生cDNA，因此先提取细胞中已知的特定mRNA，在反转录酶的作用下合成与其互补的cDNA，经限制性内切酶作用后插入载体质粒DNA内。再将该载体转化大肠杆菌，扩增cDNA，然后分离纯化cDNA，最后用缺口平移法进行同位素或生物素标记，作为探针待用。

　　寡聚核苷酸是一种短小的单链分子，比cDNA更易穿透组织细胞，并且可按基因片段的核苷酸序列人工合成。因此近年来人们常用它来制备核酸探针。

　　原位杂交细胞化学技术包括分子探针的制备，用同位素或生物素等标记探针，制作组织切片，预杂交、杂交，显色过程和结果观察等。

二.试剂和器具

1.试剂

　　主要试剂有玉米17SrRNA的cDNA，缺口平移试剂盒，硝酸纤维素膜，去离子甲酰胺，焦碳酸二乙酯，鲑精子DNA，纯牛血清白蛋白(BSA)，LB培养基，氨苄青霉素，葡聚糖，溶菌酶，十二烷基硫酸钠(SDS)，EDTA，生物素(Bio-dUTP)，金标链霉亲和素，柠檬酸，柠檬酸钠，氯化钠，对苯二酚，AgNO3，异丙醇，疏基乙醇(DTT)，醋酸钾，冰醋酸，酚，氯仿，乙醇等。

2.器具

　　主要器具有高速离心机，电泳仪，真空干燥箱，恒温摇床，超声波发生器等。

　　环境、器皿的清洁和药品的纯度是该实验成功的关键。RNA容易被RNA酶水解，而RNA酶非常稳定，所以标本和药品及器皿中应避免RNA酶的污染。

三.rDNA探针的制备和标记

　　本实验所用探针是玉米17SrRNA的cDNA，它是以1．5kb的片段插入在PBluescriptⅡSK(一)中MCS的saci位点上。

1.重组质粒的转化

(1)将大肠杆菌(E・coli)JM109单菌落接在5ml LB培养液中，37℃振荡培养过夜。

(2)以1％的接种量接入50ml LB培养液中，37℃振荡培养至OD600大约为0．3～0．4时倒入离心管，冰浴10min，4000rpm离心10min，收集菌体。

(3)将菌体悬浮于25ml预冷的50mmol/LCaCl2溶液中，冰浴30min。离心收集菌体，并重新悬于3ml 50mmol/lCaCl2中。0℃放置12－16h，使之成为感受态细胞。

(4)取重组质粒0．1μg，加在200μl感受态菌体中，冰浴30min，于42℃热休克2min后再冰浴2min。

(5)取lml LB培养液加入到上述菌液中，37℃培养45min。逐级稀释后，用内含氨苄青霉素(60μg/ml)的LB培养液涂平板，37℃培养至菌落出现。

2.转化子的筛选及检测

(1)对在氨苄青霉素平板上长出的菌落进行一次复筛，并培养菌体。

(2)按照微量DNA的提取方法(Sambrok et al．，1989)提取微量DNA，进行电泳，检测出含有重组DNA质粒的转化子。

3.重组质粒DNA的扩增及制备

(1)将经过复筛的菌落，按1中方法(2)进行大量培养。

(2)取200ml培养液，4000rpm离心10min，收集菌体，弃上清液。

(3)加入4ml溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris，10mmol/L EDTA，pH8．0)，加入溶菌酶至终浓度为4～6mg/L，振荡混匀，冰浴10min。

(4)加入8ml新配制的溶液Ⅱ(0．2N NaOH，10％SDS)，温和颠倒离心管5次，冰浴5-10min。

(5)加入6ml预冷的溶液Ⅲ(5mol/L醋酸钾60ml，冰醋酸11．5ml，重蒸水28．5ml)，颠倒离心管使之均匀后冰浴15min。

(6)12000×g离心20min，弃去沉淀。

(7)上清液加2倍体积的冷乙醇，－20℃放置1h以上。

(8)12000×g离心20min，弃上清液，取沉淀，真空干燥。

(9)将沉淀溶于500μl TEB(10mmol/LTris-HCl，lmmol/L EDTA，pH7．5)，加RNase至20μg/ml，37℃作用1-4h，以除去RNA。

(10)加等体积的饱和酚，振荡混匀后，10000rpm离心6min，取液相。

(11)在液相中加入等体积的酚：氯仿(1：1)，振荡混匀后10000rpm离心6min，取液相。

(12)在液相中加入等体积氯仿，振荡混匀，10000rpm离心6min，取液相，并加入2倍体积的冷乙醇，－20℃沉淀DNA。

(13)离心收集DNA沉淀，用70％乙醇洗涤3次，真空干燥后溶于TEB中，备用。

4.rDNA片段的制备

(1)对所得重组质粒DNA进行SacⅠ酶切，反应体系如下：SacⅠ 4μl(约20单位)，质粒DNA 50μl(20μg)，10×缓冲液(0．5mol/L Tris-HCl，pH7．5，50mmol/L MgCl2)10μl，灭菌重蒸水36μl。

(2)将反应后的混合物进行琼脂糖凝胶电泳2―3h，在紫外灯下确定DNA片段的位置，从凝胶上切下相应DNA片段的凝胶块。

(3)将上述凝胶块装入透析袋中，一端扎紧，加入450μl 0．2×TEB(10mmol/LTris-HCl，pH7．5，1mmol/L EDTA)，排除气泡，封上另一端。放入电泳槽中进行电泳，300V电泳1．5h，反向通电1min。

(4)从透析袋中吸出溶液，再加450μl 0．2×TEB冲洗透析袋，两次溶液合并后以12000rpm离心15min，除去凝胶碎块。

(5)用酚、酚/氯仿、氯仿抽提后，加入2倍体积乙醇，沉淀DNA片段，再用70％乙醇洗涤并真空干燥，用TE溶解待用。

5.rDNA片段的生物素标记

　　本实验用的标记方法是缺口平移法(Nick-translation)。其原理是在未标记的DNA探针溶液中加一定量的DNaseⅠ和DNA聚合酶Ⅰ以及生物素(或同位素)标记的三磷酸核苷酸。DNaseⅠ在DNA双链上随机切开若干个有3′-OH末端的单链切口，DNA聚合酶Ⅰ则利用标记的三磷酸核苷酸按5′-3′方向重新修补缺口，此新合成的DNA的两条链上均匀地被带上标记物。其标记方法如下。

(1)反应体系

10×生物素反应液：0．5mol/L Tris-HCl,pH7．5，50mmol/L MgCl2。

dNTP溶液：50mmol/L Tris HCl，pH7．5，每种dNTP的最终浓度为0．3mmol/L。

生物素化dUTP溶液：Bio-dUTP溶于50mmol/L Tris-HCl(pH7．5)，最终浓度为 0．3mmol/L。

DNA多聚酶Ⅰ溶液；浓度为3单位/μl，溶于0．1mol/L磷酸钠，50％乙醇，lmmol/L DTT混合液中。

DNaseⅠ溶液：浓度为0．1μg/μl，溶于10mmol/L Tris-HCl，pH7．5，lmg/ml牛血清白蛋白混合液中。

(2)取dNTP混合液(无dUTP)5μl，10×反应液5μl，DNA 4.5μl(1μg)，Bio-dUTP 7μl，酶混合液5ul，重蒸水23．5UI。混合后反应60rain，加5rd终止反应液(0．25mo1/L EDTA，pH7．5)终止反应。

(3)加入2倍体积的乙醇，沉淀DNA。

(4)用70％乙醇洗涤3次，以除尽来掺入的Bio-dUTP。

(5)真空干燥之后，以重蒸水溶解DNA，待用。

6.对标记的rDNA进行检测

采用硝酸纤维素膜固相杂交的方法进行检测。

(1)将硝酸纤维素膜剪成合适大小的长条，在2×SSC(0．15mol/L NaCl，0．015mol/L柠檬酸钠，pH7．4，等于1×)中浸泡过夜。

(2)捞出硝酸纤维素膜，空气干燥。

(3)将标记后的探针进行适当稀释，95℃水浴加热2-5min，使DNA变性。

(4)将变性后的DNA探针马上冰浴10min。

(5)将探针点在晾干的硝酸纤维素膜上，每个斑点点4μl。

(6)晾干后，将点样的硝酸纤维素膜夹在滤纸中间，80℃烘烤2h。

(7)用0．01mol/L PB，pH8．2洗涤3次，每次15min。

(8)将与胶体金相连的链霉亲和素用pH8．2的PB进行稀释，并将膜放入该液中，室温孵育60min。

(9)用0．01mol/L PB，pH8．2洗膜3次，每次15min。

(10)显影。A液(对苯二酚0．85g，柠檬酸2．55g，柠檬酸钠2．35g，水50ml)B液(AgNO3 93mg，水50ml)按1：1混匀为显影液。将膜浸泡在显影液中，避光显影至出现深色斑点。用25％海波定影1-2min。

四.原位杂交和杂交子的检测

1.原位杂交

(1)按电镜常规制片程序，将用K4M树脂包埋的玉米根、松根等材料进行超薄切片，将其捞在镍网上。

(2)将载有切片的镍网放在2×SSC液面上于700℃浸30min，以破坏rRNA的二级结构。 另取一些切片载网，先用1mg/ml RNase处理2h，用重蒸水彻底清洗。再转入2×SSC中，于70℃加热处理30min作对照。

(3)在Parafilm膜上滴25μl预杂交液(50％去离子甲酰铵，10％硫酸葡聚糖，0．05％变性鲑精DNA，2×SSC)，将切片漂浮在预杂交液上，放入保湿盒内，42℃预杂交1―2h，以防止非特异性杂交。

(4)将标记的探针加热至100℃，变性5min后马上放入冰水中，0℃冰浴10min。

(5)在预杂交液中加入变性的探针，终浓度约为0.5μg/ml，此液即为杂交液。

(6)将杂交液滴在Parafilm膜上，将预杂交的切片漂浮在杂交液上。

(7)杂交后用50％去离子甲酰胺洗两次，每次5min。

(8)载片镍网依次用2×SSC，1×SSC，0．1×SSC，重蒸水各洗两次，每次5min，空气干燥。

(9)杂交后的切片用3％BSA(0．1mol/L PB配制)封闭5min。

(10)将切片漂浮在金标链霉亲和素上(金颗粒直径为10nm，1：20稀释)，于室温放置1h。

(11)用PB洗3次，每次5min，空气干燥。

2.电镜检测杂交结果

(1)用1-2％醋酸双氧铀染色5min。

(2)重蒸水漂洗3次，每次5min。

(3)柠檬酸铅染色1min。

(4)重蒸水漂洗同(2)，空气干燥后电镜观察。

　　该实验的结果是，在玉米、松的染色体上有金颗粒分布，对照为阴性。