实时荧光定量PCR在人感染猪流感诊断中的作用

随着秋季的来临，中国本土甲流病例持续增多，聚集性疫情明显增加，防控工作面临新的严峻形势。现在已进入关键的防控措施落实阶段，其中检测与诊断技术至关重要。

实时荧光定量PCR技术在以往禽流感诊断中的应用

众所周知，虽然本次人感染猪流感事件的病毒基因序列还在进一步确立当中，但本次疫情病原学基础明确，属于RNA病毒感染性疾病。

回顾近年来感染RNA病毒的烈性传染病，如SARS、禽流感，世界卫生组织及我国卫生行政和技术部门相继制定了较为成熟的实验室检测和诊断标准，其中我国颁布的应用实时荧光定量PCR方法进行实验室检测和快速诊断的标准如《GB/T 19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》、《GB/T 19438.2-2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》、《GB/T 19438.3-2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》等

。以上实时荧光定量PCR技术在禽流感检测方面的国家标准是该技术在当前的人感染猪流感诊断中应用的基础和前提。

实时荧光定量PCR技术及在我国卫生应急中的应用要求

实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR,如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时PCR即Real-time RT-PCR）是实时PCR法，它是指对DNA或经过反转录（RT-PCR）的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。

Real Time PCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。目前被普遍使用的多种常规PCR方法如各种凝胶电泳PCR法，终点荧光定量法或PCR-ELISA法叫做终点PCR法。

实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。

普通PCR技术发明于1983年，而实时荧光定量PCR技术发明于上世纪九十年代并于1996年生产出了世界上第一台实时荧光定量PCR仪，实时荧光定量PCR技术得以实现的技术要素主要有荧光定量PCR试剂盒和实时荧光定量PCR仪，我国荧光定量PCR试剂盒研发实力强大，生产厂家较多。

临床诊断的品种如HBV/HCV及禽流感诊断试剂盒性能优良、供应充足，基本实现国产化。在猪流感病毒RNA核酸序列明确的情况下，利用现有的试剂研发平台，人感染猪流感实时荧光定量PCR诊断试剂盒很快就会面世。

实时荧光定量PCR技术在猪流感诊断中的作用已有法规确立

在人感染猪流感病毒出现以前，针对猪与猪传染的传统猪流感疫情，近年来我国科技人员经过不懈努力，探索快速检测与诊断方法].

人感染猪流感疫情发生后，美国疾病预防控制中心（CDC）于2009年4月28日发布了针对人感染猪流感病毒治疗和预防临时指南，其中规定了确诊病例的诊断方法：具有急性发烧呼吸道疾病的临床症状并且经实时荧光定量PCR （real-time RT-PCR）或病毒分离培养 （viral culture）实验室检测方法检验证实感染A（H1N1）型猪流感病毒。

卫生部办公厅于4月30日印发了《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》的通知》[7],其中在实验室检测和病例诊断报告章节，内容如下：

检测程序

呼吸道标本应首先应用real time RT-PCR方法检测A型流感病毒的M基因、Swine（ H1N1）的HA基因和NP基因，以及质控对照RNP基因。同时，接种MDCK细胞或SPF鸡胚进行病毒分离，并测定病毒的全基因组序列。

推荐检测方法

用Real-time RT-PCR方法检测猪流行性感冒（ H1N1病毒）病毒。

其他检测方法

快速流感抗原检测

病毒培养

免疫荧光法（或装配的IFA ）

显然，上述卫生部法规中，与“其他检测方法”不同，实时荧光定量PCR方法被法定为人感染猪流感诊断的推荐检测方法。