通用 PCR 技术

通用 PCR 技术，英文名是 universal PCR，是由 Mullis 等在 1983 年建立的 PCR 技术，已成为分子生物学、遗传学等学科研究领域的经典实验方法。近年来，该技术本身获得了长足发展，可靠性不断提高，在 PCR 基本原理的基础上，发展了一系列新的概念和实验方法，在生命科学研究中具有重要价值。随着该技术应用的普及和深入，某些问题也越来越突出。其中问题之一是引物，引物设计的合理与否，合成和纯化质量的好坏，直接关系到 PCR 反应的成败。不少实验室已花费大量时间和昂贵资金用于各种特异引物的设计与合成。生物种类繁多，核酸序列千差万别，以致有大量核酸片段无精力按已知序列设计合成引物后扩增。于是，探索通用引物部分代替特异引物，建立通用 PCR 是十分实用的。

通用 PCR 技术的基本原理：

根据 Tag 酶的作用原理，结合 PCR 反应液中各个反应因素和 PCR 扩增时的温度和时间变动参数的紧密联系，巧妙地创建了一个新的 PCR 工作平台和扩增环境，使 Taq 酶能在同一条件下扩增各种不同类型样品的某个特定基因片段。

因此，通用 PCR 技术的应用，不但最大限度地减轻了使用者不必要的工作量，也减少了出现操作误差和交叉污染的机会，而且加快了检验速度。与此同时，也使检测成本大幅度降低。

通用 PCR 技术可用于种群生物学，临床检验的应用，包括临床上对深部致病真菌的检测、快速全面检测感染人体多种常见支原体和衣原体的应用、对非典型分枝杆菌基因型别、物种鉴定的应用。

器材：PCR 仪

试剂：

① 基因组 DNA

② 通用引物

③ TE 缓冲液

④ 其余同常规 PCR

通用 PCR 技术的基本过程可分为如下几步：

（一）流程一

引物的设计：

引物设计是通用 PCR 中的一个重要环节，这类通用引物不是指普遍意义上的「通用」，而是狭义的通用。一般引物为 20 个碱基左右的脱氧寡核昔酸。

通用引物的设计原理是，在不同目标核酸片段两端寻找共同的保守序列。生物种往往存在大量的种、群、型、株。在进化过程中，尽管核酸序列发生了许多变异，但仍有部分短片段序列保持相同或极相近。按照这些保守序列可合成适用范围不同的通用引物，经 PCR 扩增分离，检出不同目标 DNA 片段。

目前已设计出细菌或真菌的通用引物，但至今尚无用以检验所有病毒的引物，不过仍可设计出与某些病毒家族保守片段互补的通用引物，如疱疹病毒的 DNA 聚合酶基因、糖蛋白基因引物。

rRNA 基因是目前常用的用于设计通用引物的靶基因，真核生物的 18 S rRNA 基因和原核生物的 16 S rRNA 基因相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，常用来作为微生物序列分析对象。

（二）流程二

细菌 DNA 的提取：

A. 用酚－氯仿抽提法提纯细菌 DNA：取 1 ml 菌液，3500 r/min 离心收集菌体，加入 200 μl TE 缓冲液 （pH 8.0） 制成菌悬液，再加入 120 μl 10％ SDS 轻轻混匀，置 60 ℃ 水浴 30 min。

B. 随后，加入等体积酚－氯仿 （1:1），轻轻混匀，12000 r/min 离心 10 min 后，取上清，加入 0.25 体积无水乙醇和 0.1 体积 5 mol/L 醋酸钾，12000 r/min 离心 10 min，取上清，加入 2 体积冰冷的无水乙醇，于 -20 °C 静置 30 min 后，12000 r/min 离心 10 min，去上清，沉淀用 70％ 乙醇洗 2 次，无水乙醇洗 1 次，干燥后，加入适量 TE（pH 8.0） 溶解。

（三）流程三

真菌 DNA 的提取：

A. 取真菌菌丝 0.5 g，在液氮中迅速研磨成粉。

B. 加入 4 ml 提取液，快速振荡混匀。

C. 加入等体积的 4 ml 的氯仿－异戊醇 （24:1），涡旋 3~5 min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本）。

D. 1000 r/min，4 °C 离心 5 min。

E. 上清用等体积的氯仿－异戊醇 （24:1） 再抽提一次 （10000 r/min，4 °C 离心 5 min）。

F. 取上清，加入 2/3 倍体积的 - 20 °C 预冷异丙醇或 2.5 倍体积的无水乙醇沉淀，混匀，静置约 30 min。

G. 用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用 75％ 乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗 1 次，吹干，重悬于 500 μl TE 中。

H. 加入 1 μl RNaseA （10 mg/mI），37 °C 处理 1 h。

I. 用酚 （pH 8.0）－氯仿－异戊醇 （25:24:1） 和氯仿－异戊醇 （24:1） 各抽提 1 次 （10000 r/min，4 ℃ 离心 5 min）。

J. 取上清，加入 1/10 体积 3 mol/L NaAc、2.5 倍体积的无水乙醇，- 70 ℃ 沉淀 30 min 以上。

K. 沉淀用 75％ 乙醇漂洗，风干，溶于 200 μl TE 中，- 20 ℃ 保存备用。

（四）流程四

组织细胞 DNA 的提取：

从消化过的组织中提取 DNA，组织在 100 mmol/L Tris （pH 8.0）、10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaC，0.1％ SDS、50 mmol/L DTT、0.5 μg/ml 蛋白酶 K 缓冲液中 37 °C 消化几小时。DNA 用酚抽提两次，用酚－氯仿 （1:1） 提纯一次，再用氯仿提纯一次，纯化的样品经离心透析或乙醇沉淀进行浓缩。

（五）流程五

PCR 反应体系和参数：

总体积 50 μl。其中含 4 种 dNTPs 200 Mmol/L、MgCl2 2 mmol/L、引物各 0.2 μmol/L、10× PCR 缓冲液 5 μl、Taq DNA 聚合酶 2 U、模板 DNA 1 μl 或临床标本 10 μl。

（六）流程六

PCR 反应条件及扩增产物检测：

采用热启动方式。将除 DNA 聚合酶以外的其它成分充分混匀，覆盖 30 μl 液体石蜡油，在 DNA 热循环仪上加热至 80 °C 时加入 Taq DNA 聚合酶，按以下条件扩增：94 °C 充分变性 3 min 后，以 94 °C 1 min、55 °C 1 min、72 °C 1 min 循环 30 次，然后 72 °C 充分延伸 5 min。取 10 μl 水相扩增产物作琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，中波紫外线观察、照相。

① 对于许多不同个体或生物中相同基因的扩增及测序研究，必须严格地避免在 DNA 分离及制备扩增产物时出现交叉污染。在配制 PCR 反应液时，只能使用带活动枪头及活塞的吸量器。用于扩增 DNA 的吸量器绝不能再用于组织 DNA 的分离或在另一轮扩增前稀释 DNA。不含 DNA 而含有所有其它试剂及稀释剂等的对照要包括在每次实验中，以检测污染。

② 通用 PCR 检测样本时，极易被相关生物污染造成假阳性，所以建议每次 PCR 扩增时设定阳性和阴性对照。

③ 用通用 PCR 检测细菌亦可出现假阴性反应，其发生原因有多种。包括标本中含有 PCR 抑制物质和消化提取 DNA 过程中细胞裂解不完全等。

④ 由于通用 PCR 相对于经典 PCR 特异性较弱，可以通过优化反应条件，或用降落 PCR（touchdown PCR） 等提高检出率。