PCR一般步骤

(一)总RNA提取

取液氮冻存脑组织置于玻璃匀浆器中，按100g:3ml的比例加入Trizol试剂，严格按照TrizolRNA提取试剂盒说明书的流程进行。 (1)加Trizol（按3ml/100mg组织，宁多勿少）置于玻璃匀浆器中匀浆后，冰浴10-15min。

(2)移入1.5mlEP管中，4ºC 13000g离心10min。

(3)上清液移至另一EP管中，室温放置10-15min。

(4)加入0.2ml氯仿/1mlTrizol，振荡15s，室温置5min。

(5)4ºC 12000g离心15min。

(6)仔细吸取上层水相，移至新的EP管中。

(7)加入0.5ml异丙醇/1mlTrizol，振摇，置室温10min。

(8)4ºC 12000g离心10min，EP管底部可见白色沉淀物。

(9)弃上清，纸巾吸干，加入75%乙醇1ml，振摇，充分洗涤沉淀。

(10)4ºC 11000g离心5min。

(11)吸尽乙醇，空气干燥10min（可离心加快干燥，尽量吸尽离心液体）。

(12)半透明时将RNA溶于去核酸酶的水20ul中（可吹打混匀），-20ºC冻存备用。

(13)所提取的总RNA用核酸蛋白分析仪分析RNA含量和纯度，所有标本260/280nm吸光度的比值均为1.8-2.0。

(14)取所提取的总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳，显示出清晰的28s和18s两条rRNA。

(二)逆转录反应

DEPC水 9ul dig primer 1ul 5×buffer 4ul 10M dNTPmix 2ul RNA酶抑制剂 1ul 总RNA 2ul 70ºC 5min ********************************************************** 逆转录酶 1ul ********************************************************** 20ul 42ºC 60min(+?) 70ºC 10min 4ºC ∞

(三)PCR反应

DEPC水（可用高压双蒸水） 17.5ul 10×Taq buffer 2.5ul MgCl2 2.0ul 10M dNTP Mix 0.5ul 上游引物 0.5ul 下游引物 0.5ul Tap酶(5u/ul) 0.5ul 总CDNA 1.0ul ********************************************************* 25ul PCR仪参数设置 94 ºC 5min 94 ºC ? ºC 72 ºC 30s 45s 45s 72ºC 4ºC 7min ∞

(四)电泳

(1)20ml 0.5×TBE

0.3-0.4g琼脂糖 煮沸，配成1.5-2.0%琼脂糖凝胶（RNA为1.0%）

(2)冷切至60 ºC，加入4ulEB，倒入槽中（8孔梳），室温冷切30min

(3)拔梳，加入4ulPCR产物+1ul上样缓冲液

(4)电压100-135V

(5)UVP成像系统观察

试剂配制 5×TBE配制方法（1L计） Tris-Base 54g 硼酸 27.5g EDTA 3.72g 加双蒸水至1L 2%琼脂糖凝胶配制方法 琼脂糖 0.4g 0.5×TBE 20ml EB 4ul 方法的改进版：室温冷切10min，放至4ºC冰箱20min

相关技巧

1、注意反应体系的一致，可分装

2、先P内参，检验CDNA的完整性

3、首先考虑退火温度

4、注意引物的设计

5、若目的条带无法到达指定位置，可先或晚于MAKER电泳

6、通过加量或减量PCR产物来达到灰度的调整

7、必要时可行标本间替代

8、可设计相应大小的内参来达到最终目的

9、2度水浴箱的妙用

10、必要时进行相关技术处理