巢式PCR在动物疾病诊断中的应用

巢式 PCR 在动物疾病诊断中的应用是利用巢式 PCR 技术快速、准确地对动物的疾病做出诊断。

巢式 PCR 在动物疾病诊断中的应用的基本原理是利 用两套 PCR 引物对（巢式引物）进行两轮 PCR 扩增反应（见图 16-2）, 借以提高扩增的灵敏性和 特异性。首先，以外引物（P1/P2）进行第一轮 扩增；再以第一轮扩增产物为模板，利用内引物（P3/P4）进行第二轮扩增。由于巢式 PCR 反应有两次扩增过程，因而增加了检测的敏感性；同时又因为使用了两对引物与检测模板配对，从而提高了检测的特异性。但是，两轮扩增会使检测 结果放大很多倍，如果一旦出现污染，容易产生假阳性，所以控制污染是该方法成败的关键。

图解示意：

巢式 PCR 在动物疾病诊断中的应用可用于

1. 无浆体病巢式 PCR 检测；

2. 西尼罗病毒病巢式 PCR 检测；

3. 弓形虫巢式 PCR 检测。

器材：

PCR 扩增仪、凝胶成像分析仪（美国 BIORAD 公司）

试剂：

① DNA 提取试剂盒 DNAZol Reganet（Invitrogen）

② Tag 酶

③ dNTP

④ DNA-marker

⑤ 琼脂糖

⑥ 胰酶

⑦ 蛋白酶 K

巢式 PCR 在动物疾病诊断中的应用的基本过程可分为如下几步，以猪圆环病毒的检测为例进行介绍：

1、靶基因和引物设计

靶基因的选择原则主要包括：

①各菌毒种（或属）的扩增靶基因应具有种属特异性，即为种（或属）所共有且特异；

②靶基因与其它基因应没有或仅有很低的同源性。从 NCBI 上下载靶基因序列，利用 NTI9.0 进行同源性比对，选择具有种（或属）特异性的靶基因序列，利用 Primer5.0、Oligo6.0、Array Designer4.0 等基因软件进行引物设计。

2、模板制备

组织样品中加入 3 倍的 Hank's 液，充分研磨制成悬浮液，反复冻融 3 次，8000 r/min 离心 5 min，取上清 200 μl，加入 800 μl DNA Zol 室温放置 5 min, 12000 r/min 离心 10 min, 取 950 pl 上清，加入 500 μl 无水乙醇，放置 5 min, 10000 r/min 离心 5 min；去上清，用 1 ml 75% 乙醇洗涤，10000 r/ min 离心 3 min，去上清，室温干燥，最后用 200μl 的 8 mmol/L NaOH 溶解核酸，-20 ℃ 保存备用。

3、巢式 PCR 扩增

(1) 第一轮 PCR 扩增 PCR 反应体系为 25 μl， 反应成分如下：上下游引物 P1/P2 各 0. 5 μl、2.5 mmol/L dNTP 2 μl、10 × PCR 缓冲液 2.5 μl、25 mmol/L MgCl 23 μl、DNA 模板 3 μl、Taq 酶 0.2 μl (5 U/μl)，用灭菌双蒸水补足。反应条件：95 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性 30 s，54 ℃ 退火 30 s, 72 ℃ 延伸 1 min，共进行 30 个循环；然后 72 ℃ 延伸 7 min。PCR 产物经 1.5%~2% 琼脂糖凝胶电泳检测。

(2）第二轮 PCR 扩增 PCR 反应体系为 25 μl，反应成分如下：上下游引物 P3/P4 各 0.5 μl、2.5 mmol/L dNTP 2 μl、10 × PCR 缓冲液 2.5 μl、25 mmol/L MgCl 23 μl、第一轮 PCR 扩增产物 1 μl（或 100 倍稀释）为模板、Taq 酶 0.2 μl (5 U/μl)， 用灭菌双蒸水补足。反应条件： 95 ℃ 预变性 5 min； 94 ℃ 变性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，共进行 30 个循环；然后 72 ℃ 延伸 7 min。PCR 产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳检测。

1. 模板污染控制

巢式 PCR 方法极为敏感，因此在采样或检验过程中要十分小心，以免样品污染后产生假阳性结果。将样品的处理、配制 PCR 反应液、PCR 循环扩增及 PCR 产物的鉴定等步骤分区或分室进行；吸样枪吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染；同时设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有-管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品的阴性对照。

2. 退火温度的确定

退火温度的选择原则是在引物 Tm 值允许范围内，选择较高的退火温度。通常第一轮反应可选用较低退火温度，确保目的条带的扩增；第二轮反应可以选用较高退火温度，提高特异性，消除非特异性结合。但是在单管巢式 PCR 反应中两对引物在同一管中，第一轮用较高退火温度的外引物扩增目的片段，然后降低退火温度使内引物以第一轮的产物为模板进行巢式扩增，提高敏感性。