PCR之引物详解

1. 引物是如何合成的？

　　目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。 DNA 合成仪有很多种 , 主要都是由 ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。 　　亚磷酰胺三酯法合成 DNA 片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定在固相载体上完成 DNA 链的合成的，合成的方向是由待合成引物的 3' 端向 5' 端合成的，相邻的核苷酸通过 3'→5' 磷酸二酯键连接。 　　第一步是将预先连接在固相载体 CPG 上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其 5'- 羟基的保护基团 DMT ，获得游离的 5'- 羟基； 　　第二步，合成 DNA 的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的 3' 端被活化， 5'- 羟基仍然被 DMT 保护，与溶液中游离的 5'- 羟基发生缩合反应。 　　第三步，带帽 (capping) 反应，缩合反应中可能有极少数 5'- 羟基没有参加反应 ( 少于 2%) ，用乙酸酐和 1- 甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。 　　第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 　　经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的 5'- 羟基上的保护基团 DMT ，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察 TCA 处理阶段的颜色判定合成效率。 　　通过氨水高温处理，连接在 CPG 上的引物被切下来，通过 OPC, PAGE 等手段纯化引物，成品引物用 C18 浓缩 , 脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定 OD260 定量，根据定单要求分装。 2. 引物纯化方式有哪些，如何选择？ 　　◆ C18 柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对 DNA 有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通 PCR 反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。      　　◆ OPC 纯化： OPC 纯化是根据 DNA 保护基（ DMTr 基）和 Cartridge 柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的 DNA 片段。 OPC 法纯化的 DNA 纯度大于 95% 。适用于 40mer 以下引物的纯化。 　　◆ PAGE 纯： PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对 DNA 片段进行分离，然后从凝胶中回收目的 DNA 的方法。 PAGE 纯化法也是一种非常有效的 DNA 纯化方法，纯化后的 DNA 纯度大于 95% ，对长链 Oligo DNA ( 大于 50mer) 的纯化特别有效。   　　◆ HPLC 纯化： HPLC 纯化是使用高效液相色谱的原理，对 DNA 片段进行纯化。纯度可以大于 99% 。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。　　本公司现在 OPC 与 HPLC 两种纯化方式供你选择。 

3. 引物的 OD 数如何定量？ 　　答：引物合成引物 OD 数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长 260nm ，石英比色杯，光程为 1 厘米 ，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到 0.2-1.0 之间。 DNA 干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用 1ml 水稀释测 OD 值。需要根据稀释倍数换算出母液的 OD 值。 4. 投诉定量不准是怎么回事儿？ 　　答：我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有（ 1 ）生产人员定量错误。这种可能性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格的培训，程序化规范操作和换算。公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户 OD 数，因为无论 OD 数是否达到定单要求，我们都统计为工作量，没有达到 OD 数的，分装人员将清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了。合成产量的高低是序列录入部门人员的考核指标之一。一般情况下，引物都有留样。接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题。（2）分装没有问题，但引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。这种情况很少见。（ 3 ）系统误差，我们认为 10% 左右为允许误差。使用过程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。（ 4 ）用户没有能够正确理解引物 OD 数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；用户没有将 OD 读数，正确地转换成母液中 OD 数。这种情况比较常见。（ 5 ）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。 　　例如，验证标 2OD 引物量是否准确，简单的做法是： 加入 1ml 水，彻底溶解混匀后，取 100ul, 加入 900ul 水，用光径为 1cm 的石英比色杯，波长 260nm, 此时光吸收的读数为 0.2 。

5. 需要什么级别的引物？ 　　答：引物常用的纯化方式 C18 脱盐， OPC 纯化， PAGE 纯化， HPLC 纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。