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PCR

反转录 RT-PCR 实验流程

2024-01-14 PCR 加入收藏
反转录 RT-PCR 实验流程

原理

一、总 RNA 的提取
见总 RNA 的提取相关内容。

二、cDNA 第一链的合成

目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

1.在 0.5ml 微量离心管中,加入总 RNA 1-5μg,补充适量的DEPC H2O 使总体积达 11μl。在管中加 10 uM Oligo(dT)12-18 1μl,轻轻混匀、离心;

2.70℃ 加热 10 min,立即将微量离心管插入冰浴中至少 1 min;

3.取 0.5ml PCR 管,依次加入下列试剂:第一链 cDNA 2μl;上游引物(10 pmol/μl) 2μl;下游引物(10 pmol/μl) 2μl;dNTP (2mM) 4μl;10x PCR buffer 5μl;Taq 酶(2 u/μl) 1μl。轻轻混匀,离心。42℃ 孵育 2-5 min;

4.加入 SuperscriptⅡ 1μl,在 42℃ 水浴中孵育 50 min;

5.于 70℃ 加热 15 min 以终止反应;

6.将管插入冰中,加入 RNase H 1μl ,37℃ 孵育 20 min,降解残留的 RNA。-20℃ 保存备用。

三、PCR

1.取 0.5ml PCR 管,依次加入下列试剂:第一链 cDNA 2μl;上游引物(10 pmol/μl)2μl;下游引物(10 pmol/μl)2μl;dNTP (2 mM) 4μl;10x PCR buffer 5μl;Taq 酶(2 u/μl)1μl;

2.加入适量的 ddH2O,使总体积达 50μl。轻轻混匀,离心;

3.设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28-32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在 PCR 扩增目的基因时,加入一对内参(如 G3PD)的特异性引物,同时扩增内参 DNA,作为对照;

4.电泳鉴定:行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果;

5.密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。

用途

1.获取目的基因的 DNA 分子片段;

2.检测目的基因表达情况;

3.重组表达载体的构建。

材料与仪器

组织、细胞 RNA 提取试剂、RNase 抑制剂、dNTP 混合物、TaqDNA 聚合酶、第一链 cDNA 合成试剂盒、离心管、离心机、水浴锅、PCR 热循环仪、PCR 管、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶图像分析系统、移液管、移液枪、离心管盒、正向引物和反向引物、琼脂糖;

步骤

一、总 RNA 的提取
见总 RNA 的提取相关内容。

二、cDNA 第一链的合成

目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

1.在 0.5ml 微量离心管中,加入总 RNA 1-5μg,补充适量的DEPC H2O 使总体积达 11μl。在管中加 10 uM Oligo(dT)12-18 1μl,轻轻混匀、离心;

2.70℃ 加热 10 min,立即将微量离心管插入冰浴中至少 1 min;

3.取 0.5ml PCR 管,依次加入下列试剂:第一链 cDNA 2μl;上游引物(10 pmol/μl) 2μl;下游引物(10 pmol/μl) 2μl;dNTP (2mM) 4μl;10x PCR buffer 5μl;Taq 酶(2 u/μl) 1μl。轻轻混匀,离心。42℃ 孵育 2-5 min;

4.加入 SuperscriptⅡ 1μl,在 42℃ 水浴中孵育 50 min;

5.于 70℃ 加热 15 min 以终止反应;

6.将管插入冰中,加入 RNase H 1μl ,37℃ 孵育 20 min,降解残留的 RNA。-20℃ 保存备用。

三、PCR

1.取 0.5ml PCR 管,依次加入下列试剂:第一链 cDNA 2μl;上游引物(10 pmol/μl)2μl;下游引物(10 pmol/μl)2μl;dNTP (2 mM) 4μl;10x PCR buffer 5μl;Taq 酶(2 u/μl)1μl;

2.加入适量的 ddH2O,使总体积达 50μl。轻轻混匀,离心;

3.设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28-32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在 PCR 扩增目的基因时,加入一对内参(如 G3PD)的特异性引物,同时扩增内参 DNA,作为对照;

4.电泳鉴定:行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果;

5.密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。

注意事项

1.在实验过程中要防止 RNA 的降解,保持 RNA 的完整性。在总RNA 的提取过程中,注意避免 mRNA 的断裂;

2.为检测提取的 RNA 中是否有 DNA 污染要设置阴性对照;

3.内参的设定:主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差;

4. PCR 不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定;

5.防止 DNA 的污染:采用 DNA 酶处理 RNA;在可能的情况下,将 PCR 引物置于基因的不同外显子,以消除基因和 mRNA 的共线性。

常见问题

1.反转录酶的选择

(1) Money 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:有强的聚合酶活性,RNA 酶 H 活性相对较弱,最适作用温度为 37℃;

(2)禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:有强的聚合酶活性和RNA 酶 H 活性。最适作用温度为 42℃;

(3)Thermus thermophilus、Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录酶:在 Mn2+ 存在下,允许高温反转录 RNA,以消除 RNA 模板的二级结构;

(4)MMLV 反转录酶的 RNase H-突变体:商品名为 Superscript 和 SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的 RNA 转换成 cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长 cDNA。

2.合成 cDNA 引物的选择

(1)随机六聚体引物:当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时,体系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板,PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96% 来源于 rRNA。

(2) Oligo (dT):是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3' 端 Poly (A+) 尾,此引物与其配对,仅 mRNA 可被转录。由于 Poly (A+) RNA 仅占总 RNA 的 1-4%,故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性方面均要小。

(3)特异性引物:最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物,若 PCR 反应用二种特异性引物,第一条链的合成可由与 mRNA 3' 端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA,导致更为特异的 PCR 扩增。


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