AFLP分子标记技术及其应用

（北京师范大学生命科学学院生态学专业）

摘 要：扩增片段长度多态性 (AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的分子标记技术。文章主要讲述该技术的原理、流程及特点，并从以下三个方面讲述该技术的应用情况：动物学方面，讲述其在动物遗传学，动物系统学，性别鉴定与繁殖行为研究上的应用；植物学方面，讲述其在种质资源鉴定，作物育种上的应用；医学方面，讲述其在肿瘤，遗传病，流行病学方面的进展。文章还分析了AFLP技术的优缺点并展望了其应用前景。

关键词：AFLP，分子标记技术，应用

目前遗传标记主要有4种类型，即形态标记(Morphological Markers)、细胞标记(Cytological Markers)、生化标记(Biochemical Markers)和分子标记(Mo1ecular Markers) [1]。分子标记一般指DNA标记。分子标记依据所用的分子 生物 学技术,大致分为三大类：

(Ⅰ)以电泳技术和分子杂交技术为核心,其代表性技术有RFLP和DNA指纹技术(DNA Fingerprinting) 。

（Ⅱ）以电泳技术和PCR技术为核心,其代表性技术有RAPD( Random amplified polymorphism DNA) 、SSLP(Simple sequence length polymorphism ,或称Sequence-tagged microsatellitesite, STMS)和AFLP。

（Ⅲ） 基于DNA芯片技术的分子标记,即SNP[ 2-4 ]。其中，扩增片段长度多态性 (AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism)，是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法，已获欧洲专利局的发明专利。

该技术具有多态性丰富、灵敏度高、稳定性好、可靠性高、不易受环境影响等优点，近年来广泛应用于生命科学各项研究中。

1. AFLP分子标记技术原理、流程及特点

1.1. AFLP分子标记技术原理

AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。

使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。

扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性[5]。Vos等(1995)曾对AFLP的反应原理进行了验证，结果检测到的酶切片段数与预测到的酶切片段数完全一致，充分证明了AFLP技术原理的可靠性。

进行AFLP分析时，一般应用两种限制性内切酶在适宜的缓冲系统中对基因组DNA进行酶切，一种为低频剪切酶，识别位点为六碱基的rare cutter；另一种为高频剪切酶，识别位点为四碱基的frequent cutter。

双酶切产生的DNA片段长度一般小于500bp，在AFLP反应中可被优先扩增，扩增产物可被很好地分离，因此一般多采用稀有切点限制性内切酶与多切点限制性内切酶相搭配使用的双酶切。目前常用的两种酶是4个识别位点的Mse I和6个识别位点的EcoR I。

AFLP接头和引物都是由人工合成的双链核苷酸序列。接头(Artificial adapter)一般长14～18个碱基对，由一个核心序列(Core sequence)和一个酶专化序列(Enzyme-specific sequence)组成。常用的多为EcoR I和Mse I接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物的结合位点。AFLP引物包括三部分：5′端的与人工接头序列互补的核心序列(core sequence，CORE)，限制性内切酶特定序列(enzyme-specific sequence，ENZ)和3′端的带有选择性碱基的粘性末(selective extension，EXT)。

1.2. AFLP分子标记技术流程

AFLP分子标记技术包括3个步骤：

(Ⅰ)DNA的准备。即DNA的酶切以及与人工合成的寡聚核甘酸接头(artificial oligonucleotide adapter)连接。为了使酶切片段大小分布均匀，一般采用双酶酶切，在基因组上分别产生低频切口和高频切口。

(Ⅱ)选择性扩增酶切片段。AFLP引物包括与人工接头互补的核心序列(CORE)、限制性内切酶识别序列(ENZ)和3′端选择性碱基三部分。一般用不带或带1个选择性碱基的引物进行预扩增，然后用带2～3个选择性碱基的引物进行再扩增。所用引物可用放射性或荧光标记。

(Ⅲ)AFLP标记的统计。AFLP产物通过聚丙酰胺变性凝胶电泳(SDS—PAGE)检测样品的多态性，可灵敏地分辨只有一个碱基差异的不同DNA片段。[6]