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PCR

降落 PCR基本方案

2024-05-15 PCR 加入收藏

原理基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到

原理

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)

　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：

　　　　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

　　循环次数　　循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

材料与仪器

基因样品
引物去离子水 DNA聚合酶缓冲液 dNTP MgSO4(可选)和DMSO（可选）
PCR

步骤

1. 反应体积为50 ul。

2. 人CD137胞膜外区基因的PCR扩增体系：CD137-pCDNA3质粒4 ul，P1，P2各0.5 umol/L，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。

3. hIgG1Fc片段的PCR扩增体系：含人hIgG1Fc的PGEM-T质粒4 ul，P3、P4各0.4 umol/L，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。

4. HBVDNA多聚酶基因的PCR扩增体系：

（1）第一轮：HBVDNA模板4 ul，P5、P6各0.25 umol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U.

（2）第二轮：取5倍稀释的第一轮PCR产物4 ul为模板，P7、P8各0.25 umol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U。

5. 分别在各灭菌PCR管加入上述各反应成分，100℃煮沸5 min，立即冰浴5 min，加入TaqDNA聚合酶，混匀，离心，PCR程序如下：