聚合酶链式反应（PCR）详细步骤

一、准备工作

1、实验器具与材料：

（1）移液枪：200ul、10ul

（2）吸头：200ul、20ul

（3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个

（4）EP管1.5ml、100ul

2、实验器具的处理与准备

塑料制品：（包括吸头、EP管等）

送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。

3、试剂配制和准备：

（1） 双蒸水： 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水，送至高压，后分装到几个1。5mlEP管中，-20℃中保存备用。

（2） PCR中所需要的各种试剂

二、PCR时注意事项：

佩戴一次性手套，同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

三、PCR步骤

1、准备100ul EP管

2、依次在管中加入：（50ul反应体系）

3、稍离心

4、100℃沸水浴1分钟

5、趁热加入Tag酶0.5ul（冰上操作）

6、再加入50ul液体石蜡封闭

7、10000rmp离心1分钟

8、PCR条件

94℃ 1min

58℃ 50sec

72℃ 1min30sec

进行40个循环，然后72℃ 10min 完后4℃保温。

9、10000rmp离心5min

10、将下层水相转入新的0.65mlEP管中，－20℃保存。