PCR基因芯片上荧光PCR反应的研究

基因芯片技术具有快速多样、微型化和自动化等特点在生物医学领域广泛的应用。但由于其基本原理是基于核酸杂交技术，有着内在的缺陷，实验的敏感性和重复性都存在一定问题。核酸杂交较适合于检测基因的表达，不易检测基因组DNA的基因的重排，突变和缺失。

而大多数肿瘤性疾病和一些遗传变异和表型的改变与后者有关。为了解决上述问题，我们将芯片技术与荧光PCR技术相结合，设立设计一种含有大量微反应池的PCR基因芯片，以期能快速、准确的对基因的重排，突变和缺失等基因变异进行检测。

常规PCR反应产物的检测是电泳后观察获得基因片段的大小，PCR基因芯片的关键问题是如何检测出来在微反应池内获得的极其微量PCR产物。本文应用一些临床病例的实例标本，观察能否在基因芯片上进行不同的荧光PCR反应，如何根据基因芯片上荧光的变化判断基因的变异。

1、病例、材料与方法

1.1　基因组DNA标本

健康成年人外周血DNA，正常脐血DNA，X连锁遗传性铁粒幼细胞贫血（XLSA）家系成员6人外周血DNA均获自北京大学第一医院，均签署知情同意书。XLSA家系中患者为兄弟两个，年龄分别为8、7岁，都在婴儿时即发现贫血。家中有一个健康的姐姐，在两兄弟出生前，母亲曾有多次男胎自然流产史。成熟红细胞形态呈典型的小细胞低色素性贫血，骨髓铁染色可见大量环形铁粒幼细胞。临床初步诊断遗传性铁粒幼细胞贫血。

1.2　PCR基因芯片的设计与制作

PCR基因芯片上制备大量微反应室，可以同时进行不同的PCR反应。采用单抛525mm厚硅片作为衬底材料。硅片常规清洗后，在10～50℃下生长800nm厚的湿氧热氧化层，作为第一层掩膜层。然后150nm厚的Si3N4低压化学气相淀积（LPCVD）在硅片表面，形成第二层掩膜。

第一次光刻，RIE刻蚀反应室及其流道上的Si3N4；采用掩膜板2光刻反应室的图形，RIE和BHF刻蚀反应室表面的SiO2。KOH腐蚀反应室的硅至150um，此时流道上的硅由于有足够厚的SiO2作为保护层，没有开始腐蚀。腐蚀掉流道上的SiO2，同时进行反应室及流道上继续SiO2的腐蚀，KOH腐蚀的速度为1um/min，芯片进行热氧化生长300umSiO2，以增强其表面的亲水性，保证反应液可以在芯片内顺利流动。芯片通过PVC聚合物压合封闭。

1.3　PCR基因芯片上应用Taqman荧光探针

1.3.1　PCR扩增XLSA家系ALAS2基因第五外显子并且获得基因片段　　经查询ALAS2基因的全长序列。应用Primer3.0软件设计第五外显子引物——上游引物：5’-ccataagtcaatgactgagc-3’，下游引物：5’-aagtggtgatagaacccaag-3’。在94℃3分钟，然后94℃30秒、56℃30秒、72℃1分钟共30个循环，72℃延伸5分钟条件下进行PCR反应。取0.5EP管，加入7ulPCR产物及3ulSSCP上样缓冲液，96℃变性10分钟。10%SSCP-聚丙酰胺凝胶及银染色。PCR产物交上海博亚公司直接测序。

1.3.2　PCR-SSCP方法分析按照我室常规进行。

1.3.3　Taqman荧光探针 以发现的ALAS2基因第五外显子点突变为中心设计，序列如下：5’（荧光集团）FAM-CAAGATCATAGAGAAGAAAC-TAMRA（淬灭集团）3’，设计Taqman荧光PCR反应的上下游引物。序列如下：上游引物：5’-tcagttatgaccagtttttcaggg-3’，下游引物：5’-gaacacacggtaggtgtgatcct-3’。

1.3.4　常规实时定量PCR检测ALAS2基因第五外显子基因突变在GeneAmp® SDS 5700荧光PCR仪上进行，反应条件50℃2分钟，94℃10分钟，然后94℃30秒，60℃30秒共40个循环。

1.3.5　PCR基因芯片上进行PCR反应　用0.5ml清洁医用注射器缓慢吸取Taqman荧光PCR反应液。刺破芯片表面PVC封膜，沿加样孔缓慢将反应液加入，用透明胶带封住加样孔。将芯片放入Gene Amp PCR System 2400 PCR仪，行PCR反应，探索不同反应条件。