PCR of Trouble shooting guide

1. 阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有：

（1）模板核酸的制备。

（2）引物的质量与特异性。

（3）酶的质量。

（4）PCR循环条件。

模板：

（1）模板中含有杂蛋白质。

（2）模板中含有Taq酶抑制剂。

（3）模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白。

（4）在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

（5）模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因为酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时PCR时忘了加Taq酶或电泳时忘了加溴化乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

（1）选定一个好的引物合成单位。

（2）引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

（3）引物使用过程中应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

（4）引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20 μl、30 μl、50 μl或100 μl，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20 μl 后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，否则容易失败。

物理原因：温度对PCR扩增来说相当重要。如果变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；

退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下PCR仪或水浴锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

2. 假阳性

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：

（1）是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：

①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外。

②除了酶及其他不耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头均应一次性使用。

③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

（2）是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

3. 出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次，是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：

（1）必要时，重新设计引物。

（2）减低酶的量或调换另一来源的酶。

（3）降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

（4）适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸，也叫两步法）。

4. 出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶的量过大或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有： （1）减少酶的量，或调换另一来源的酶。

（2）减少dNTP的浓度。

（3）适当降低Mg2+浓度。

（4）增加模板量，减少循环次数。