PCR技术在癌症的运用

癌症为基因突变造成的疾病，是由于细胞生长、分化及分裂繁殖等有关的基因产生病变所造成的。这些基因包括促进细胞分裂及繁殖的致癌基因，抑制细胞分类及繁殖或促进细胞分化的抑癌基因。

当致癌基因过度活化或抑癌基因不活化而使细胞分类繁殖不受控制时，细胞就渐渐进入癌化的过程。因此癌细胞常包括有多个基因的突变，而不同的癌症又有不同的基因病变。

如慢性骨髓性白血病会产生BCR-ABL的病变基因；又如以消化系肿瘤而言，大肠癌常有RAS致癌基因及P53抑癌基因的突变。

因此侦测这些癌细胞特有的重要基因病变，除了可以做为临床诊断的依据外，也可做为治疗效果及预后追踪的指标。

癌症相关基因的病变可分成：

（1）基因少数几个碱基的变化：包括点突变，碱基的减少或增多，如RAS致癌基因常有condon12、13或61点的突变

（2）基因的缺损：如P53抑癌基因，在癌细胞常有整个基因的缺失

（3）基因的数目增多：如有些癌胞常有MYC基因数目增多的情形

（4）染色体转位：如BCR-ABL就是因染色体转位而产生的病变基因

（5）基因的甲基化：当甲基化发生在一个基因promoter区的CG聚集区时，会造成该基因的不活化。在癌细胞内，常可发现抑癌基因被甲基化而不活化的情形。在过去（1985年以前），这些基因病变除了大的缺损外，往往无法在短时间内侦测出。

自从聚合酶连锁反应（polymerase chain reaction，简称PCR）的方法被发明后，这些基因的病变可很快速的被侦测出，基因诊断才能真正的被临床应用。

聚合酶连锁反应（PCR）是一种快速增多已知基因或DNA片断的方法。在过去我们要增多基因是要先找出想要测的基因，然后将它送入细菌或嗜菌体内，利用它们快速的繁殖速度，以获得大量的欲检测的基因，然后再作进一步的分析。

因此，从受到检体到作出结果，往往需要一年半载，这样的方法根本无法用于临床，更不用说技术的困难度。有了PCR的技术后，病变基因的诊断方法才可真正的用于临床。

这个方法要先设计两条寡核苷酸的引子（称primer），一条对应欲测DNA片断前端的正股，另一条对应后端的负股，然后利用互补的双股DNA在高温下会变成单股，及回温后又会变成双股的特性，以进行DNA的增多反应。

将欲测的DNA，寡核苷酸引子，酵素及其它原料放入同一管中，加热至94℃使它变成单股，然后降温到恰当温度，使合成的寡核苷酸引起与欲测的DNA结合形成双股的结构，DNA制造酵素就可以此引起为起点，开始制造与欲测DNA相同的DNA片断，再将温度升到最适合酵素反应的温度（一般是72℃）。

DNA片断就可很正确的被产生出来。由于新制造出来的DNA片断，可被重复利用，当做下一个cycle制造DNA的模板，因此，DNA的制造速度是以等比级数进行，当进行20个cycles的反应后，DNA就可增加约106倍。

有了PCR这种可以随意增多任何已知DNA片断的方法后，它就可用于任何微生物的快速诊断，如与肝癌有关的B型肝炎或C型肝炎，与子宫颈癌有关的乳突状病毒，又可利用更新的定量PCR方法，来侦测病人经治疗后，病毒量的变化，以评估治疗的效果。

至于病变基因的侦测，当然也不适问题。我们可利用PCR的方法增多病变基因，然后再利用基因定序仪，决定病变基因突变的碱基，或利用核酸内切酶，切割突变的位置……等等，有相当多有效的方法可侦测病变所在，而这些方法的关键技术就是PCR。

又有的病变牵涉到不同染色体上两个基因的转位，而其转位的确切位置变化相当大，因此，无法直接以DNA当模板，增多该区域来做诊断。在这种情形，则须要利用反转录酶PCR的方法（简称PT-PCR）。

RT-PCR的方法，是以RNA当检验的材料，利用反转录酶先将它转变成互补的DNA（称cDNA），然后再设计二条寡核苷酸的引子，分别对应cDNA的序列，以便进行PCR的反应。

以侦测慢性骨髓性白血病的BCR-ABL突变基因为例，我们设计一条寡核苷酸引子来对应BCR基因的cDNA，另一条对应ABL的cDNA。

然后进行RT-PCR：正常的细胞没有BCR-ABL的病变基因，ABL及BCR基因是分开的基因产物，因此，此两条引子就各自反应，PCR的结果只是等加级数的增加，30 cycles后只增加30倍而已，无法用一般的方法显示出来。

但当遇到慢性骨髓性白血病的检体时，因其中有BCR-ABL的病变基因，RT-PCR的产物一端是BCR基因，另一端是ABL基因，产物可以一再的被二条寡核苷酸引子利用。

因此，就产生等比级数的增加，重复做了30 cycles后，BCR-ABL的变异基因片断可增多至接近10亿倍，所以很容易的就可利用一般的洋菜胶电泳法侦测到。

又如基因的不活化，除了基因有真正的碱基突变外，另一种情形是基因起动店附近的CG聚集区被甲基化，这种变化也可利用甲基化PCR的方法（methylation PCR）侦测。

这种方法首先要利用一种化学药物（Sodium Bisulfite）将欲测的DNA中的“C”碱基变成“T”，当有CG的甲基化时，“C”就无法变成“T”，我们可根据这样的差异设计甲基化PCR所须的寡核苷酸引子，以进行反应。

由于PCR技术改变了整个生物科学的研究，除了以上所提外，广泛地使用于各种生命科学，如生物的演化及物种的起源、罪犯鉴定、亲子鉴定、品种鉴定……等等。是二十世纪末最重要的发明之一，因此其发明人Mullis KB，在不到10年后即获得诺贝尔奖。