PCR-ELISA端粒酶检测法

端粒是真核生物染色体末端的特异DNA-蛋白结构，端粒DNA是一系列重复的富含G的DNA序列，这一序列在生物进化中有高度的保守性（人重复序列为TTAGGG）。已确认端粒在保护基因组DNA不被降解、防止染色体有害的结合（如染色体末端融合、重排、染色体移位和染色体缺失）中起重要作用。

由于DNA聚合酶不能复制线性DNA的最末端，多数正常体细胞的端粒末端每经一个复制循环就进行性缩短。这一现象在体内和体外都得到证实，并且可能与高级真核生物的正常体细胞有限的繁殖能力有关。

这一活性可能在与细胞衰老有关的情况中起作用。与体细胞相对照，生殖细胞是永生性的，它需要为将来器官形成保存全部的遗传信息。因此它必须对抗端粒缩短。这一工作通过在基因组染色体的末端添加新的端粒重复序列而完成。

端粒酶是一种核糖核蛋白，它们用自身的RNA成份的互补序列作模板，催化TTAGGG重复序列加到染色体末端。在大多数永生性细胞株和肿瘤细胞株中也可见端粒酶活性的表达。端粒酶反应超越了细胞的增殖限制，这可能是恶性肿瘤发生的一个先决条件。

传统的端粒酶研究方法是以探针延伸为基础测定端粒酶活性。由于需要大量的样品材料，且检验灵敏度受局限,这一方法已被端粒重复扩增法（Telomeric Repeat Amplification Protocol,TRAP）所取代。

标准的TRAP测定是通过PCR扩增端粒酶反应的产物，使用放射性标记，经凝胶电泳后，通过放射自显影显示结果。

这里介绍使用非放射性标记的检测端粒酶的新方法：活性光密度酶联免疫测定法。这种方法具有如下特点：

安全，无需使用放射性同位素

一步反应，使用即用的混合物使端粒酶介导的引物延伸和PCR扩增可在一个试管中进行。

应用广泛，扩增后可适用于不同分析法。

灵敏，与放射性同位素TRAP测定相当。

可靠，准确、重复性好。

快速，6-8小时得到结果。

现介绍如下：

1.原理：

本法是建立在Kim等人描述的TRAP方法的基础上的，它将端粒酶介导的衍生产物进行PCR扩增,并与后序的ELISA法结合在一起。本法可分如下几步：

（1）延伸/扩增：

第一步：端粒酶将端粒重复序列（TTAGGG）加到带有生物素标记的P1-TA引物的3’末端。

第二步：利用引物P1-TS和T2通过PCR扩增这些延伸出的产物，产生出的PCR产物带有特异的端粒酶-6-核苷酸的延伸产物。

（2）ELISA测定：

PCR产物变性后与Dig标记的端粒特异的重复检测探针杂交。终产物可经生物素标记的探针固定到亲和素包被的微量滴定板上。固定的PCR产物可用与过氧化物酶交联的抗地高辛复合物（anti-Dig-POD）检出。最后，经过分解底物TMB形成一种有色的反应物，再用酶标仪进行检测。

2.应用：

本法可用于从培养细胞和其他生物样品的抽提物进行端粒酶活性的高敏感性检测。

3.检测步骤：

3.1样品制备：

3.1.1细胞提取物的制备：

—按标准方法采集并进行细胞记数（trygan染色，使用血细胞计数器。）

—每个反应取2*105细胞移入一个新的试管。

—2-8℃下以3000g离心10分钟形成细胞团。

—小心移去上清液，将细胞在PBS中重悬并重复离心步骤。

—小心移去上清液，细胞小团可放在-80℃下储存。

—若准备细胞提取物，将细胞小团在200μl裂解试剂中重悬，冰上预冷并提吸至少3次，冰中孵育30分钟。如果将冷冻细胞团用于提取，加入裂解液前在冰上融化细胞团。

—2-8℃，16000g离心裂解物20分钟。

—小心移去上清液并移入新的离心管中。保证将细胞残渣带入，我们推荐仅抽吸175μl细胞提取物。

—继续进行TRAP反应。

—如不立即进行TRAP反应，将小份细胞抽提物在液氮中休克性冷冻，将提取物储存在-80℃。