原位 PCR

原位 PCR 利用了成熟发达的 PCR 或 RT-PCR 技术，使目的基因可以在固定组织或细胞的原位扩增；从而保证在亚细胞结构不被改变或破坏的情况下，允许目的基因在细胞的不同亚室中扩增并被检测到。

根据目标核酸的不同，原位 PCR 可分为以 DNA 为目标的原位 PCR 和以 RNA 为目标的原位RT-PCR，两种均需要先将组织或细胞样品固定后使用蛋白酶对细胞进行通透处理，再进行核酸扩增过程；

根据扩增和检测方法的不同又分为直接法和间接法：

1.直接法（即原位 PCR）基本原理是在进行原位 PCR 之前，将标记好的核苷酸或引物加入到PCR反应液中，随着扩增的进行，标记物直接掺入到 PCR 产物中，然后用放射自显影、免疫组织化学或荧光检测术对靶核酸分子进行细胞内定位及检测。

2.间接法（又称原位杂交 PCR）基本原理是将组织、细胞标本固定并用蛋白酶消化处理后，先通过 PCR 扩增靶细胞内特定的核苷酸序列，再结合原位杂交进行核苷酸序列的检测及细胞内定位。

本实验以直接法原位 PCR 为主介绍，间接法原位 PCR（原位杂交 PCR ）实验详情见另一实验详情页—原位杂交 PCR。

原位 PCR 常用于研究疾病的发病机理、临床过程及病理的转归、分子生物学、细胞学、分子病理学及临床诊断领域等。

具体应用举例如下：

1.在样品中目标核酸含量低，原位杂交法灵敏度不够时，可采用原位 PCR 以高特异性、高灵敏度检出样品内的微量核酸；

2.确定目的基因或病毒的亚细胞定位；

3.可用于确定拥有某目的基因的细胞数量或百分比，如协助确定感染某种特定病毒的细胞数量，或具有激活的病毒基因表达的细胞数量，具有肿瘤基因的细胞百分比，确定转移性肿瘤的来源等；

4.快速鉴定细菌物种等等。

1.仪器：
①原位 PCR 仪
②恒温培养箱及湿盒
③显微镜
④离心机
⑤ AES 处理的载玻片、盖玻片
⑥微量移液器、枪头（灭菌）

2.试剂：
①材料：培养的细胞或组织切片
② 4% 多聚甲醛、过氧化氢溶液、1xPBS、蛋白酶K及其缓冲液、BSA、50 mM 醋酸缓冲液 pH 5.0、AES 溶液、50xDenhardt’s 溶液
③上游引物及下游引物（20 μmol／L）、dNTP 混合液、Taq DNA 聚合酶、10 x PCR 反应缓冲液、标记的 dUTP（如 Bio-dUTP 或 DIG-dUTP）、随机引物、（原位 RT-PCR 还需RNA酶抑制剂、DEPC，反转录酶等）
④ 20 x SSC、4 x SSC、2 x SSC 和 0.1 x SSC
⑤中性树胶或其他封片剂
⑥反应框及配套封盖膜

一、试剂配制

（1）4％ 多聚甲醛固定液，2% AES 溶液；
（2）蛋白酶 K：储存液-用灭菌水溶解蛋白酶 K 粉末至 1mg/mL，-20 °C 贮存；工作液-现用现配，使用 PBS 稀释 150 倍；
（3）PCR 缓冲液（10x）500 mmol／L KC1,100 mmol／L Tris-HCl（pH 8.4）， 15 mmol/L MgCl2，0.5% Tween20，1 mg/L BSA；
（4）PCR 反应液：上下游引物各 1.25uM，dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 200μmol， 标记的 -dUTP 50mol，1×PCR 缓冲液；用 0.1 mol／L NaOH 调节 pH 值至 7.0～7.5，使其浓度为 5 mmol／L，分装后 -20 °C 保存；
现也有商品化的混合液（各 2 mmol／L）供应。
（5）Taq DNA 聚合酶 5 U／μl
（6）DNAse 工作液：40 mM Tris HCl，pH 7.4 的 6 mM 氯化镁，2 mM CaCl2 和 1 U/uL终浓度的 DNase（配制后 60min 内使用）；
（7）RT 反应液：上下游引物各 1.25uM，dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 1mmol， RNA酶抑制剂 20U，1uM 下游引物，反转录酶 10U，1×PCR 缓冲液，DEPC 水补足；
（8）封闭液：在 100 mM Tris HCl (pH 7.8)中加入 50 mg/mL BSA，加入 150 mM NaCl和 0.2 mg/mL 叠氮化钠；
(9）Buffer A：混合等量的 100mM Tris HCl (pH 7.5)和 150mM NaCl；
（10）碱性底物缓冲液：混合等量的 100mM Tris HCl (pH 9.5)， 150mM NaCl 和 50mM MgCl2；
（15）NBT：75 mg/mL NBT（70% 的二甲基甲酰胺配制），现配现用；BCIP：50 mg/mL（100% 二甲基甲酰胺配制），现配现用；
（16）4 x SSC、2 x SSC和0.1 x SSC 用20 x SSC 稀释（20 x SSC：3 mol／L NaCl， 0.3 ml／L 柠檬酸钠，用1 mol／L HCl 调节 pH 至 7.0）。

二、原位 PCR（分为原位 PCR 和原位 RT-PCR 两部分）

（一）原位 PCR（DNA Target）
1.样品制备：选取较薄的组织切片、细胞爬片或细胞悬液制备样品，并使样品置于提前高温高压灭菌并用 AES 预处理的载玻片上；
2.自然晾干，105°C 加热 90-120 秒；
3.样品固定：4% 多聚甲醛 4 小时后，立即放入 3xPBS中10min 洗涤 1 次，期间不定时的将玻片上下晃动；然后在 1xPBS 中 10min 洗涤，期间不定时的将玻片上下晃动，重复 1 次；再放入 ddH2O 中 1min，自然晾干（如若后期显色使用过氧化酶显色方案，需先使用 0.3%过氧化氢室温 10 分钟或 4°C 过夜进行过氧化氢酶阻断后使用 1xPBS 清洗一次再进行固定过程）；
4.蛋白酶 K 消化：（不同厚度、固定方法不同及来源不同的组织切片、不同细胞系均必须先进行蛋白酶 K 消化的优化过程，以确定蛋白酶K的工作浓度及消化时间，详见注意事项）如最佳工作浓度为 6ug/ml 的蛋白酶K 37°C 消化 15min 后，立即将切片置于 95°C 加热2min，终止消化，1xPBS 洗涤一次，ddH2O 洗涤一次，自然晾干；
5.PCR 扩增：在样品周围贴好反应框，并配制 PCR 反应液，滴加至样品上，用配套的封盖膜覆盖，放入原位PCR仪进行PCR过程：94°C 3 min，45–65 °C（依据引物设定）1min，72°C 1–5 min (依据产物大小），30 循环；小心去掉封盖膜，92°C 加热 1min；
6. 使用 2xSSC 室温清洗载玻片 5 min，重复 1 次。

（二）原位 RT-PCR（RNA Target）

用于原位 RT-PCR 的试剂和材料必须提前使用 DEPC 处理，清除 RNA 酶
1.样品制备：选取较薄的组织切片、细胞爬片或细胞悬液制备样品，并使样品置于提前高温高压灭菌并用 AES 预处理的载玻片上；
2.自然晾干，105°C 加热 5-10 秒；
3.样品固定：4% 多聚甲醛 4 小时后，立即放入 3xPBS 中 10min 洗涤 1 次，期间不定时的将玻片上下晃动；然后在 1xPBS 中 10min 洗涤，期间不定时的将玻片上下晃动，重复 1 次；再放入 ddH2O 中 1min，自然晾干（如若后期显色使用过氧化酶显色方案，需先使用0.3% 过氧化氢室温 10 分钟或 4°C 过夜进行过氧化氢酶阻断后使用 1xPBS 清洗一次再进行固定过程）；
4.蛋白酶 K 消化：（不同厚度、固定方法不同及来源不同的组织切片、不同细胞系均必须先进行蛋白酶 K 消化的优化过程，以确定蛋白酶K的工作浓度及消化时间，详见注意事项）如最佳工作浓度为 6ug/ml的蛋白酶K 37°C 消化 15min 后，立即将切片置于 95°C 加热 2min，终止消化，1xPBS 洗涤一次，ddH2O 洗涤一次，自然晾干；
5.DNAse 处理：将配制好的 DNAse 工作液滴加到样品上，放于湿盒密封，37°C 过夜；使用配制 DNAse 的溶剂（无 DNAse）清洗一次，再用 DEPC 水清洗一次；
6.反转录反应：配制 RT 反应液，滴加至样品上，放于湿盒密封，42°C 孵育1h，95°C 加热2min 终止反应，ddH2O 清洗两次，自然晾干；
7.PCR 扩增：在样品周围贴好反应框，并配制 PCR 反应液，滴加至样品上，用配套的封盖膜覆盖，放入原位 PCR 仪进行PCR过程：94°C 3 min，45–65 °C（依据引物设定）1 min，72°C 1 min (依据产物大小），30 循环，最后一个循环 72°C 延伸 10min；小心去掉封盖膜，92°C 加热 1min；
8. 使用 2xSSC 室温清洗载玻片 5 min，重复 1 次。

三、比色检测

（一）基于过氧化物酶的生物素化探针的比色检测
1.将载玻片放入 1xPBS 中清洗两次，每次 5min；
2.滴加 10uL 链霉亲和素-过氧化物酶复合物（用 PBS 配制，终浓度为 100 ug/mL, pH 7.2）加盖封盖膜，于 37°C 孵育1h；
3.除去反应框，使用 1xPBS 清洗两次，每次 5min；
4.滴加 100uL AEC（含 0.03% 过氧化氢的 50mM 的醋酸缓冲液，pH 5.0）；37°C 避光孵育 10 分钟显色，在显微镜下观察颜色，若颜色不深，可再孵育 10 分钟；
5.用自来水冲洗玻片终止显色并晾干；滴加中性树胶封片；
6.光学显微镜分析被染成棕红色的阳性细胞。

（二）基于碱性磷酸酶的生物素化探针的比色检测
1.将载玻片放入 2xSSC 中，室温浸泡 15min，重复一次；
2.滴加 100uL 封闭液，室温孵育 15min；
3.配制偶联工作液（现用现配）：用偶联稀释缓冲液（100 mM Tris HCl, 150 mM MgCl2, 10 mg/mL BSA 和 0.2 mg/mL 叠氮化钠，充分混匀）将链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物稀释成终浓度为 4ug/mL 的偶联工作液；
4.移去封闭液，滴加 100uL 新鲜配制的偶联工作液覆盖样品，放于湿盒内室温孵育 15min；
5.将载玻片放入 Buffer A 浸泡清洗两次，室温，每次 15min；
6.将载玻片在碱性底物缓冲液中洗涤一次，室温，5 分钟。
7.将 50mL 的碱性底物缓冲液预热至 37°C。在加入载玻片之前，再加入 200uL NBT 和 166uL BCIP，混匀；
8.将载玻片放入第 7 步预热至 37°C 的 NBT/BCIP 碱性底物缓冲液中孵育显色，直至显微镜下能够看到棕色（约 60min），全程避免样品干燥；
9.用 ddH2O 冲洗载玻片终止显色并晾干，中性树胶封片；
10.光学显微镜分析被染成深棕色的阳性细胞。

（三）地高辛标记探针的比色检测
1.滴加 100uL 过氧化物酶标记抗地高辛抗体（按抗体说明书以封闭液稀释，现用现配）以覆盖样品，放入湿盒密封，37°C 孵育 1h；
2.PBS 清洗三次，滴加 100uL AEC（20mg AEC 溶于 2.5 ml N,N-二甲基甲酰胺，并加入终浓度为 0.03% 过氧化氢的 50mM 的醋酸缓冲液，pH 5.0）；37°C 避光孵育 10 分钟显色，在显微镜下观察颜色，若颜色不深，可再孵育 10 分钟；
3.用自来水冲洗玻片终止显色并晾干；滴加中性树胶封片；
4.光学显微镜分析被染成棕红色的阳性细胞。

（四）荧光标记探针杂交后检测
1.PBS 清洗玻片三次，每次 5min；
2.滴加抗荧光淬灭封片剂封片，使用荧光显微镜观察分析。

1.载玻片使用 AES 处理能够有效增加对细胞和组织黏附性；

2.原位 RT-PCR 请注意使用 DEPC 处理所用材料和试剂，防止 RNA 降解；

3.反应框和配套的封盖膜比盖玻片更适用于原位 PCR，能够有效避免因盖玻片的除去造成的固定的组织或细胞脱落。

4.在探针的使用与保存注意防止探针污染和降解，荧光探针注意避光保存。

蛋白酶K需要进行条件优化以确定最佳的消化时间，具体流程如下：
（1）准备 4 - 5 张相似组织的切片。
载玻片需要是连续的切片或制备非常相似，随后须对根据各种载玻片的形态进行比较确定消化条件。
（2）准备等量的浓度梯度蛋白酶K溶液。
（3）确定消化的标准时间和温度，例如，37°C 15min。
（4）将载玻片在设定的条件下严格按照标准连续处理。
（5）在 95°C 下加热切片 2 分钟，停止消化。
（6）涂片用苏木精或其他适当染色。
（7）在高倍光学显微镜下观察切片，观察细胞的形态变化。
（8）选择变化不显著的蛋白酶K最高浓度作为优化浓度。
（9）如果所有的切片都有变化，则用较低浓度的蛋白酶K或较短的孵育时间重复上述过程。
（10）如果玻片没有任何变化，则增加浓度或孵育时间，并重复该过程，直到找到合适的条件。
（11）一旦确定了最佳的消化方式，利用这些条件处理特定组织的所有玻片、固定方法和切片厚度。后三个参数的任何变化都需要重新优化消化过程。

1. 阳性细胞中阳性信号形态不正常
蛋白酶 K 消化过度。消化的条件因根据样本来源作出调整，淋巴细胞室温消化 5-10min，神经组织室温消化 12-18min，石蜡固定的组织室温消化 15-30min；具体消化的优化过程详见注意事项。

2.高背景、有非特异信号
退火温度不适合或者引物特异性不好。更换引物进行特异性验证后再进行原位 PCR；在设定退火温度时，先设定较高的退火温度，使用 touchdown 方案，在前 10-20 循环内，每一循环降低 1°C，这样会提高信噪比以获得更好的结果。

3.假阳性或无阳性信号扩增
核酸降解、扩增反应体系有问题、引物退火问题、扩增产物过大，蛋白酶 K 消化不足。先检查样品的完整性，再确定反应体系的配比是否正确，扩增产物一般要求不高于 350bp，蛋白酶 K 消化问题见注意事项。
如若是原位 RT-PCR，则可能由于实验中 RNA 酶的存在导致 RNA 降解，应使用 DEPC 水处理相关材料和试剂。
在配制 PCR 反应体系时注意在冰上进行。