AluPCR:用重复序列引物扩增来源复杂的人DNA

引言

　　聚合酶链反应PCR使不同来源的特异核酸片段的分离及分析发生了革命，但应用PCR分 离，分析特定DNA区域需要了解靶区域的边侧序列，这使扩增局限于已知DNA序列。我 们研究了从复杂的人和其他种DNA混合物中扩增未知DNA序列。特别是，我们应用PCR 分离出了在啮齿类细胞背景中含有人染色体片段的体细胞杂合体中的人DNA。使存留 在杂合子中的人特异区域序列得到分离和鉴定，避免了克隆DNA库和用人特异重复序 列探针他离人序列克隆。我们所用的方法，即AluPCR，也已被证明可从克隆中快速分 离插入的人类DNA，这将PCR的应用扩大到克隆于Lambda和酵母人工染色体(YAC)载体 上的基因组DNA，PCR在大基因组区域上的应用为分析人基因提供了另一个工具。 　　AluPCR方法特点在于利用人DNA中普遍存在的Alu重复序列，这种300bp序列的拷贝约 900.000个，分布于整个人基因组。虽然Alu重复序列各拷贝间有很大差别，但已确定 出了一个相同序列，且重复子中一些区域是极为保守的。我们认为，可设计合适的能 识别这些保守区的PCR引物，进行有效的内-Alu扩增，从复杂源中分离人DNA。为了只 扩增体细胞杂合子中人DNA而不同时扩增啮齿类Alu等位子，我们需要鉴定人特异引 物。 从杂合细胞株中扩增人特异DNA 　　我们合成了大量引物，测试了它们扩增人、体细胞杂合子及啮齿类DNAs的能力。图1 所示为用TC-65和#278两个引物增的结果，#278识别啮齿类DNA扩增啮齿类序列，而 TC-65引物对人DNA物异，从X-3000-11.1杂合细胞株(含Xq24-qter，是人类特有的中 扩增出数目不同的带。值得注意的是，TC-65引物在310bp的灵长类特异的插入区中， 此插入区在人Alu序列的第二个重复子上而#278引物则定位于哺乳类Alu-等位子中高 度保守的重复部分，关于所涉及的反应条件及引物的详细描述，已送出版。 　　下面概述一下我们的发现。序列的扩增量似乎依赖于寡聚核苷酸引物量及在总目的 DNA中人类目的DNA所占的量。最初的有效引物TC-65是含有17个碱基的Alu序列和含一 个NotI酶切点的13碱基5'端外延序列，设计NotI酶切位点是为了克隆扩增的产物。单 独使用TC-65只在方向相反间距5-6kb的Alu序列间进行扩增。但也并不扩增所有这样 的Alu序列时，而是偏向于某些特异的Alu重复子。杂合细胞株X-300011.1表现出这一 现象(图1)，该株中，TC-65引物扩增出的带数在50-100间，该杂合子中含约40Mb人 DNA，认为Alu重复对特异地适合用这种引物扩增。     　　图1.用Alu引物从体细胞杂合子中扩增人DNA。用TC-65引物和#278引物从人， X3000-11.1，仓鼠和小鼠中扩增DNA的PCR结果。