差异显示技术(DD-PCR)及其应用

高等植物在其生命活动过程中，由于基因的选择性表达，决定了高等植物生命活动的多样性和连续性。在植物的生长、发育、衰老和死亡过程中，都有不同的基因起作用。因此，研究基因的选择性表达，掌握其对植物生命活动的调控，克隆新基因，是分子生物学的重要课题。

1992年，Liang和Pardee［1］首次提出差异显示技术(DD-PCR)，并且利用这一技术克隆了几个基因。由于该技术具有快速、灵敏、简单和可分析低丰度mRNA的优点［2］，很快成为克隆新基因和研究植物基因表达的有力工具。这项技术最初用于医学研究上，近年来已开始在高等植物研究中应用，为研究高等植物的发育、生理代谢、基因表达提供了重要的技术手段。

1、差异显示技术的原理和实验程序

差异显示的基本原理是，利用一系列的oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。

其技术一般包括下列步骤：

(1)从植物组织中提取总RNA，在这个步骤中注意不能有DNA污染，一般用无RNA酶的DNA酶在37℃下处理30 min；(2)在逆转录酶作用下，以Oligo T11MN 为引物(M为G、A、C中的任一种，N为A、C、G、T任一种)，进行逆转录；(3)PCR反应，扩增cDNA的第一条链；(4)扩增后的cDNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使差异表达的cDNA片段在6%测序胶上分开；(5)找出不同处理间差异显示的条带，从胶上切割下来，并回收，再进行第二次扩增；(6)克隆差异片段，差异片段可作为探针；(7)Northern 杂交，验证目的片段，去掉假阳性片段；(8)对目的片段进行测序；(9)以克隆的目的片段为探针，从基因组文库中筛选出相应的全长基因。

2、差异显示技术的应用

差异显示技术由于充分利用PCR技术和反转录，因此比较快速，且利用该技术能够观察细胞中mRNA的组成，了解植物不同发育阶段或不同环境条件下的细胞之间的差异表达，克隆目的基因。此项技术常用于下列领域。

2.1 基因表达

Vielle-Calzada［3］和Nuccio利用差异显示技术研究了狼尾草的基因表达情况，发现狼尾草的有性生殖和无融合生殖的子房在基因表达上不同。用2个锚定引物和20个10碱基的随机引物，共显示出2268个cDNA片段。其中有3个基因片段(pcs-2,pca-2,pca-3)能在有性生殖的子房中特异表达，表明无融合生殖子房可能缺少某些基因，而表现无融合生殖。

Brigham等［4］研究碗豆根尖和界面细胞的mRNA和蛋白质的差异表达后指出，两种细胞的mRNA差异与蛋白质差异具有高度的相似性，界面细胞的分化与蛋白表达的变化有关。利用差异显示技术可以揭示植物根的形态建成。Bachem等［5］利用差异显示技术，揭示了马铃薯块茎在不同发育阶段的基因表达情况，并同时比较了马铃薯块茎不同发育时期的mRNA表达情况，认为在块茎形成过程中有2个lox基因，不同时期产生的mRNA数量不同。Opsahl等［6］发现，玉米胚特定区域才能表达的基因——ZmEsr，在开花前4～7d内表达，之后表达量逐渐减少。张立平等［7］比较了水稻对铝敏感品种和抗性品种，在铝胁迫条件下，苗期抗性品种和敏感品种基因表达有明显差异。

2.2 基因的鉴定与克隆

差异显示技术目前已成为鉴定和克隆基因的重要方法。

Hannappel等［8］利用一对近等基因系，研究了西红柿基因组特异区。这对近等基因系中有一个含有抗烟草花叶病毒(TMV)抗性基因Tm-2a，一个不含。这两个近等基因系有一个差异片段，克隆后经Northern杂交证实是阳性克隆，并且发现，这个片段与抗性有密切关系。Joshi［9］利用修饰的差异显示法克隆了小麦HSP70基因族的3个公认的基因，他认为差异显示法在很短时间内就可以克隆基因。Knaap和Kende［10］克隆了水稻的赤霉素调控基因，利用赤霉素处理水稻，一个诱导，一个不诱导，发现二者在差异显示时，mRNA表达量相差10倍，因而很容易克隆了一个赤霉素调控基因。Sharma和Davis［11］利用差异显示法，分析了拟南芥对臭氧的反应。

拟南芥用臭氧处理后，在根和成熟花中，臭氧诱导的转录物AtOZI 1 mRNA含量极高，是叶的3～5倍。序列分析证明，AtOZI 1编码一个Mr8600蛋白多肽，其序列与已知的蛋白序列基本一致，充分表明差异显示方法是克隆基因的有效方法。赵大中等［12］比较春化过和不春化的小麦，发现春化20d的小麦有一个与春化相关的cDNA克隆，经Northern杂交和同源性分析，证明VRC54是春化特异克隆片段，该克隆片段的基因对春化需求型植物的成花诱导起重要作用。