real-time PCR技术的原理及应用

一、实时荧光定量PCR原理

（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。

（二）实时原理

1、常规PCR技术：

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。

2、实时定量PCR技术：

利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析

3、如何对起始模板定量？

通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.

4、几个概念：

（1）扩增曲线 ：

（2） 荧光阈值：

（3）Ct值：

CT值的重现性：

5、定量原理：

理想的PCR反应： X=X0*2n

非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n

n：扩增反应的循环次数

X：第n次循环后的产物量

X0：初始模板量

Ex：扩增效率

5、标准曲线

6、绝对定量

1）确定未知样品的 C(t)值

2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量