用PCR、GC发夹及变性梯度凝胶电泳检测突变

变性梯度胶凝电泳(DGGE)能够将具有单个碱基差别的DNA分子分离开来。分离以 DNA在溶液中的解链特性为基础。

以温度或变性剂浓增高时，DNA分子在不同的区域相 对应的解链温度称为基础。解链区域的长度从25个碱基对到数百个碱基对不等，与每 一个解链区域相对应的解链温度称为解链温度(Tm)。由于一个DNA链上相邻碱基间的 堆积作用在DNA双螺旋的稳定上起着相当重要的作用，因此解链区域的Tm值主要取决 于核苷酸的序列。

既使是很小的变化也会引起DNA片段Tm值的改变，如单碱基替代可 引起1.5℃的差异。在DGGE系统中，DNA片段在变性剂梯度聚丙烯酰胺凝胶中电泳，凝 胶中自上而下所含变性剂浓度呈线性增加。DNA片段在进入变性剂某一浓度时，此浓 度下DNA片段在最低温度解链区域解链(相当于该区域的Tm值)，此时DNA分子成分枝状 结构，它使DNA分子在胶中的移动减慢。如果梯度条件选择恰当，因单个碱基变化使 不同的DNA片段在凝胶中的不同位置分叉，随后DNA片段移动减慢，从而使笪DNA片段 最终分离开来。

DGGE可以用来检测除最高温度解链区域以外的所有发生单个碱基变化的DNA片 段。例如一个DNA片段有三个解链区域，其中头两个区域中的碱基变化能够检测到；但 是最后一个区域的碱基变化，由于缺乏完全解链区域时依赖序列移动的DNA片段，一 般不能检测。

我们能够利用克隆的DNA片段通过一个富含GC片段与有两个解链区域的 DNA片段结合来解决这一困难，富含GC的片段我们称之为GC发夹。当缺乏GC发夹时， 只有那些发生在此DNA片段第一个区域所发生的单碱基变化可用DGGE分开；而GC发夹与 该DNA片段结合能够区分第二区域所发生的单碱基改变。

\par我们对GC发夹的研究最 初是通过将突变的DNA片段克隆入一个质粒载体，使其与一个含80%鸟嘌呤与胞嘧啶的 300bp片段连接，并用限制性内切酶隆解此克隆DNA，使之释放出与GC发夹结合的靶片 段。虽然该方法是行得通的，但是要设计一个适合于直接检测基因组DNA片段、特别 是带有长达300bp的GC发夹的片段仍然存在着困难。克服这个困难的第一步是有关的 实验观察以及理论推算，结果表明GC发夹长为30bp就足能用于绝大多数DNA片段的 DGGE分析。

第二步进展在聚合酶链反应(PCR)基础上，设计一方法使短的GC发夹与DNA 基因组结合。该方法是根据一篇报道，即有限制性内切酶位点的DNA短片段能够与寡 核苷酸相连，此寡核苷酸用于PCR扩增DNA片段；这些在DNA基因组织中未编聯的寡聚核 苷酸的wè5'尾斣陂织PCR过程中有效地掺入扩增的DNA片段的5'末端。

我们最近将该原 理用于DGGE方法，结果表明长40-45bp的GC发夹能够与来源于人基因组的扩增DNA片段 结合，此GC发夹能检测发生单个碱基变化的DNA片段，而当其缺乏GC发夹时，DGGE检 测不到。PCR扩增过程中DNA片段的大量扩增增加了灵敏度，所以只需少量DNA样品， 经EB染色的DNA可以很容易地检测出来，因而不需使用放射性探针。

因不需与放射性 探针杂交，此法也能比较容易地检测低、中和高拷贝数的重复序列，而这些序列用 Southern杂交来分析有时是十分困难的。在此将详细描述本方法的实验过程，并且专 门讨论该方法如何用于完整的从短到中等长度的基因的分析。

策略

利用PCR扩增基因组或者克隆的DNA样品，两条寡核苷酸链与DNA的两侧相结合。 其中一条链的5'末端附加40-45nt的GC富含序列；该5'末端结构在PCR过程中掺入扩增 的DNA片端的5'末端。扩增的DNA片段在对待测DNA浓度合适的变性剂梯度胶中电泳， 凝胶用EB染色、紫外检测。因突变或中性多态性而具有一个碱基差别的DNA片段在凝 胶中迁移到不同的位置，经EB着色呈现不同的带。

在开始使用PCR/GC发夹方法前有几个方面需予以考虑。如下面将要讨论的，尽管 可用DGGE检测和1000bp的DNA片段，但该方法检测500bp和更短的DNA片段更为有效。 在PCR扩增以及DGGE过程中，可用几种不同的方法来选择寡核苷酸以达到最佳实验结 果。此外，有三种不同的方法来决定对于每个扩增DNA片段最佳的变性梯度以及电泳 时间。