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材料与仪器EDTA 矿物油 TN 缓冲液 PCR 缓冲液 聚合酶混合液 XmaⅠ XmaⅠ缓冲液 DNAdNTP 溶液 各稀释的第二次杂交样品 PCR 引物热循
材料与仪器
EDTA 矿物油 TN 缓冲液 PCR 缓冲液 聚合酶混合液 XmaⅠ XmaⅠ缓冲液 DNAdNTP 溶液 各稀释的第二次杂交样品 PCR 引物
热循环仪 水浴箱 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备 酚
热循环仪 水浴箱 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备 酚
步骤
第 1 阶段：用于 MOS 和 XmaⅠ消化的 PCR 扩增
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
EDTA,0.2mol/L
矿物油
TN 缓冲液（10 mmol/LTris-HCl、pH7.6，10mmol/LNaCl)
2. 酶和酶缓冲液
PCR 缓冲液，10X(40 mmol/LTricine-KOH、22°C 下 pH9.2,3.5 mmol/L 乙酸镁，10mmol/L 乙酸钾，75 mg/mlBSA，或者厂商提供）
聚合酶混合液，50X(Advantage2，Clontech，或相当产品）
XmaⅠ(10U/ul)
XmaⅠ缓冲液，10X
3. 核酸和寡核苷酸
DNA
dNTP 溶液（包含所有 4 种 dNTP，各 10 mmol/L)
各稀释的第二次杂交样品（来自方案 2 第 17 步）
PCR 引物 P1
PCR 引物 NP2R
PCR 引物 P1
4. 专用设备
热循环仪
水浴，预设为 37°C 和 74°C
5. 附加试剂
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备
酚：氯仿抽提和乙醇沉淀所需的试剂
二、方法
1. 用于 MOS 的初级 PCR 扩增
(1) 从每个稀释的第二次杂交产物中（来自方案 2 第 17 步）各取 10ul，加到标记好的管子中。
(2) 按照下表，配制用于初级 PCR-1 的主体混合液。这个配方足够做一个反应。根据要按比例扩大。对于每个反应，按照下表将试剂混合。
(3) 混匀，并短暂离心。
(4) 将 115ul 主体混合液分装到第 1 步的反应管中。
(5) 将最终的 125ul 混合液，分装到 5 个 0.5 ml(原文为 ul—译者改）的 PCR 管中(每管 25ul)。
(6) 用 1 滴矿物油覆盖。
(7) 将反应混合液在热循环仪中 74°C 温育 5 min，以延伸接头，然后立即开始以下循环。
(8) 从 5 个初级 PCR-1 产物中，各取 2ul 到一个管中混合，并加 390ulH20。
(9) 从第 8 步稀释的每个初级 PCR-1 产物混合液中，各取 1ul 到一个标记妤的 PC 管中。
(10) 按照下表，配制用于初级 PCR-2 的主体混合液。
(11) 混勻，并短暂离心。
(12) 将 24ul 主体混合液分装到第 9 步的各反应管中。
(13) 用 1 滴矿物油覆盖。
(14) 立即开始以下循环。
(15) 从每个反应产物中，各取 4ul 在 2.0% 琼脂糖凝胶上分析。
2. 用于 MOS 的次级 PCR
(16) 从上面第 14 步产生的每个初级 PCR-2 混合液中，各取 2ul, 用 38ulH20 稀释。
(17) 从每个稀释的初级 PCR-2 产物混合液中，各取 2ul，分装到标记好的管子中。
(18) 按照下表，配制用于次级 PCR 的主体混合液。这个配方足够做一个反应，根据需要按比例扩大。对于每个反应，按照下表将试剂混合。
(19) 混匀，并短暂离心。
(20) 将 48ul 主体混合液分装到第 2 步的反应管中。
(21) 用 1 滴矿物油覆盖。
(22) 立即开始进行 10~12 个循环：95°C 10s，68°C10s,72°C1.5 mm。
(23) 从每个反应产物中各取 4ul 在 2.0% 琼脂糖凝胶上分析。
(24) 用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀纯化次级 PCR 产物。
(25) 用 20~40ulTN 缓冲液溶解沉淀，使 DNA 浓度为 20ng/ul
(26) 取 2ul 纯化的 PCR 产物，在 2.0% 琼脂糖/溴化乙锭凝胶上分析。
(27) 用 1.6 mlH20 稀释 14 第 10 步纯化的 PCR 产物（这将作为未消化的对照）。
(28) 反应产物保存在-20°C。
3.XmaI 消化
(29) 在管中加入下列试剂
(30) 混匀，然后在 37°C 温育 2 h。
(31) 加入 2ul 0.2mol/LEDTA，以终止反应。
(32)74°C 温育 5 min, 使酶失活。
(33)-20°C 保存。
第 2 阶段：MOS 杂交
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
稀释缓冲液（20 mmol/LHEPES-HC1、pH8.3,50 mmol/LNaCl 和 0.2 mmol/LEDTA)
4X 杂交缓冲储存液：4mol/LNaCl，200 mmol/LHEPES、pH8.3,4 mmol/L 十六烷
基三乙基溴化铵（CTAB)，最终的 1X 杂交混合液用稀释缓冲液来稀释矿物油
2. 核酸和寡核苷酸
XmaI 消化的 DNA
3. 专用设备
热循环仪
二、方法
1. 在一个 1.5 ml 的离心管中，混合以下试剂。
2. 从混合液中，取 2ul 到一个 0.5 ml 的离心管中，用 1 滴矿物油覆盖。
3. 在热循环仪中 98°C 温育 1.5 min。
4. 在热循环仪中 68°C 温育 3 h。
5. 在管中加 200ul 稀释缓冲液，并吹吸混匀。
6. 在热循环仪中 70°C 加热 7 min。
7.-20°C 保存。
第 3 阶段：MOSPCR 扩增
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
dNTP 溶液（包含所有 4 种 dNTP, 每种为 lOmmol/L)
矿物油
2. 酶和酶缓冲液
PCR 缓冲液，lOX（4Ommol/L Tricine KOH、22°C 下 pH9.2，3.5 mmol/L 乙酸镁，10 mmol/L 乙酸钾，75 mg/mlBSA, 或者厂商提供）
聚合酶混合液，50X(Advantage2,Clontech, 或相当产品）
3. 核酸和寡核苷酸
稀释的 DNA 样品（杂交后的样品及相应的未消化对照，方案 4 第 2 阶段第 6 步和方案 4 第 1 阶段第 26 步）
MOSPCR 引物（NP2Rs)
4. 专用设备
热循环仪
5. 附加试剂
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备
二、方法
1.按照下表，为所有的 MOSPCR 配制主体混合液。
2.在标记好的含有 24ul 主体混合液的管子中，各加 lul 稀释的 DNA 样品（杂交后样品及相应的未消化对照）。
3.用 1 滴矿物油覆盖。
4.将反应混合液放在热循环仪中，74°C 温育 5 min, 以延伸接头（不要将样品从热循环仪中取出）。
5.立即开始下面的循环。
6.从每个管中，各取 4ul 在琼脂糖凝胶上分析。
7.反应产物保存在-20°C。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
EDTA,0.2mol/L
矿物油
TN 缓冲液（10 mmol/LTris-HCl、pH7.6，10mmol/LNaCl)
2. 酶和酶缓冲液
PCR 缓冲液，10X(40 mmol/LTricine-KOH、22°C 下 pH9.2,3.5 mmol/L 乙酸镁，10mmol/L 乙酸钾，75 mg/mlBSA，或者厂商提供）
聚合酶混合液，50X(Advantage2，Clontech，或相当产品）
XmaⅠ(10U/ul)
XmaⅠ缓冲液，10X
3. 核酸和寡核苷酸
DNA
dNTP 溶液（包含所有 4 种 dNTP，各 10 mmol/L)
各稀释的第二次杂交样品（来自方案 2 第 17 步）
PCR 引物 P1
PCR 引物 NP2R
PCR 引物 P1
4. 专用设备
热循环仪
水浴，预设为 37°C 和 74°C
5. 附加试剂
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备
酚：氯仿抽提和乙醇沉淀所需的试剂
二、方法
1. 用于 MOS 的初级 PCR 扩增
(1) 从每个稀释的第二次杂交产物中（来自方案 2 第 17 步）各取 10ul，加到标记好的管子中。
(2) 按照下表，配制用于初级 PCR-1 的主体混合液。这个配方足够做一个反应。根据要按比例扩大。对于每个反应，按照下表将试剂混合。
(3) 混匀，并短暂离心。
(4) 将 115ul 主体混合液分装到第 1 步的反应管中。
(5) 将最终的 125ul 混合液，分装到 5 个 0.5 ml(原文为 ul—译者改）的 PCR 管中(每管 25ul)。
(6) 用 1 滴矿物油覆盖。
(7) 将反应混合液在热循环仪中 74°C 温育 5 min，以延伸接头，然后立即开始以下循环。
(8) 从 5 个初级 PCR-1 产物中，各取 2ul 到一个管中混合，并加 390ulH20。
(9) 从第 8 步稀释的每个初级 PCR-1 产物混合液中，各取 1ul 到一个标记妤的 PC 管中。
(10) 按照下表，配制用于初级 PCR-2 的主体混合液。
(11) 混勻，并短暂离心。
(12) 将 24ul 主体混合液分装到第 9 步的各反应管中。
(13) 用 1 滴矿物油覆盖。
(14) 立即开始以下循环。
(15) 从每个反应产物中，各取 4ul 在 2.0% 琼脂糖凝胶上分析。
2. 用于 MOS 的次级 PCR
(16) 从上面第 14 步产生的每个初级 PCR-2 混合液中，各取 2ul, 用 38ulH20 稀释。
(17) 从每个稀释的初级 PCR-2 产物混合液中，各取 2ul，分装到标记好的管子中。
(18) 按照下表，配制用于次级 PCR 的主体混合液。这个配方足够做一个反应，根据需要按比例扩大。对于每个反应，按照下表将试剂混合。
(19) 混匀，并短暂离心。
(20) 将 48ul 主体混合液分装到第 2 步的反应管中。
(21) 用 1 滴矿物油覆盖。
(22) 立即开始进行 10~12 个循环：95°C 10s，68°C10s,72°C1.5 mm。
(23) 从每个反应产物中各取 4ul 在 2.0% 琼脂糖凝胶上分析。
(24) 用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀纯化次级 PCR 产物。
(25) 用 20~40ulTN 缓冲液溶解沉淀，使 DNA 浓度为 20ng/ul
(26) 取 2ul 纯化的 PCR 产物，在 2.0% 琼脂糖/溴化乙锭凝胶上分析。
(27) 用 1.6 mlH20 稀释 14 第 10 步纯化的 PCR 产物（这将作为未消化的对照）。
(28) 反应产物保存在-20°C。
3.XmaI 消化
(29) 在管中加入下列试剂
(30) 混匀，然后在 37°C 温育 2 h。
(31) 加入 2ul 0.2mol/LEDTA，以终止反应。
(32)74°C 温育 5 min, 使酶失活。
(33)-20°C 保存。
第 2 阶段：MOS 杂交
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
稀释缓冲液（20 mmol/LHEPES-HC1、pH8.3,50 mmol/LNaCl 和 0.2 mmol/LEDTA)
4X 杂交缓冲储存液：4mol/LNaCl，200 mmol/LHEPES、pH8.3,4 mmol/L 十六烷
基三乙基溴化铵（CTAB)，最终的 1X 杂交混合液用稀释缓冲液来稀释矿物油
2. 核酸和寡核苷酸
XmaI 消化的 DNA
3. 专用设备
热循环仪
二、方法
1. 在一个 1.5 ml 的离心管中，混合以下试剂。
2. 从混合液中，取 2ul 到一个 0.5 ml 的离心管中，用 1 滴矿物油覆盖。
3. 在热循环仪中 98°C 温育 1.5 min。
4. 在热循环仪中 68°C 温育 3 h。
5. 在管中加 200ul 稀释缓冲液，并吹吸混匀。
6. 在热循环仪中 70°C 加热 7 min。
7.-20°C 保存。
第 3 阶段：MOSPCR 扩增
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
dNTP 溶液（包含所有 4 种 dNTP, 每种为 lOmmol/L)
矿物油
2. 酶和酶缓冲液
PCR 缓冲液，lOX（4Ommol/L Tricine KOH、22°C 下 pH9.2，3.5 mmol/L 乙酸镁，10 mmol/L 乙酸钾，75 mg/mlBSA, 或者厂商提供）
聚合酶混合液，50X(Advantage2,Clontech, 或相当产品）
3. 核酸和寡核苷酸
稀释的 DNA 样品（杂交后的样品及相应的未消化对照，方案 4 第 2 阶段第 6 步和方案 4 第 1 阶段第 26 步）
MOSPCR 引物（NP2Rs)
4. 专用设备
热循环仪
5. 附加试剂
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备
二、方法
1.按照下表，为所有的 MOSPCR 配制主体混合液。
2.在标记好的含有 24ul 主体混合液的管子中，各加 lul 稀释的 DNA 样品（杂交后样品及相应的未消化对照）。
3.用 1 滴矿物油覆盖。
4.将反应混合液放在热循环仪中，74°C 温育 5 min, 以延伸接头（不要将样品从热循环仪中取出）。
5.立即开始下面的循环。
6.从每个管中，各取 4ul 在琼脂糖凝胶上分析。
7.反应产物保存在-20°C。
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