PCR-聚合酶链反应的进展

在聚合酶链反应(PCR)的方法建立以前，面院DNA长链上某种基因的变化有很大难度。1983年由Kry Mullis 等利用当时已经发现的DNA聚合酶，首先建立的体外DNA序列扩增法，基本方法是用寡核苷酸引物扩增位于两个已知序列之间的DNA序片段。

反应在DNA聚合酶催化下完成。引物的序列分别与模板基因的序列互补，分别结合在模板DNA对应的两条单链的目的基因的两端随着引物序列从5’～3’延伸合成。在过量的两种引物的四种dTTP，dATP，dCTP，dGTP存在的情况下，模板ONA通过加热而变性，然后冷却到一定温度，两个引物退火，结合到了对应的模极序列上。

DNA聚合酶使退火后结合在模板上的引物开始延伸。随后，反复重复变性，退火，DNA延伸等合成步骤。由于每一次扩增后的产物又可充当下一循环的模板，所以每一次循环基本上都能使靶DNA产物的量扩增一倍。

1985年，Saiki用这种方法检测时常发生于非洲黑人中的镰刀红细胞贫血获得了成功。PCR从此进入实用阶段。由于PCR操作相对不很复杂，应用前景广阔，因此短短几年已经广泛渗透到医学各个阶段，发表论文和专著数以千计。

迄今各种PCR的实验方法虽然有一些改进变化，但是基本原理是一致的。PCR的主要产物是双链DNA，在目的基因两端设计了两条特异性的引物，引物的5’末端限定了扩增的目的序列的长度，其长度等于两引物间的距离。

在PCR过程中，第一循环扩增产生的DNA大小是不均一的，其长度可以超出两个引物结合部位间距离。

在第二循环后，以第一循环产物为模板所扩增出的DNA分子的长度便固定了，并在以后的循环中以成倍速度积累，成为PCR的产物尽管在每一循环中，以起始的DNA为模板所产生的较长片段的产物也仍在不断的扩增，但它们是以线性方式增加，因此对最终产物的影响不明显。

1983年设计的PCR操作是用E.olic DNA聚合酶的Klenow段催化延伸过程。由于这种酶在PCR变性时的高温下失活，所以在每一循环中的合成步骤之前，都需要加入新鲜的酶。耐热性Taq　DNA聚合解决了这个问题。

Taq聚合酶是从嗜热菌(Thermusaquaticus)中纯化出来的。可耐95℃的水浴温度，在变性步骤中不失活。因此不需要在每一循环后重新加入新鲜的酶。因为引物的退火和延伸可以在较高的温度广进行，引物的错误启动作用大大减少，从本质上改善了扩增反应的特异性、效率及扩增产物的长度。

仅仅用0.5μg的模板DNA，经30～35周期的循环后，就可以获得0.5～1μg的靶序列DNA产物，序列长度可达12kb.

PCR在遗传性疾病的诊断，临床标本中病原体检查，法医学标本的遗学鉴定(来源于毛发或单个精细胞的DNA)，分析被激活的痛基因的突变情况都有应用。

这些应用都进于从PCR基本技术中扩展的一系列研究方法。这些方法已经作为各种分子克隆技术和DNA分析的基本技术，可以用于：

1．用微卫星做染色体基因定位，寻找基因缺失。

2．获得特异性序列基因表达生产蛋白或者作为分子探针。

3．从微量mRNA中产生cDNA文库。已经发展了直接比较正常和遗传变异基因的方法。

4．用于直接序列测定分析。

5．获得基因片段分析基因突变，SSCP，DGGE，异源双链形成。目前已经用PCR做基因的定量分析。

一、用微卫星确定染色体的基因丢失

最近发现，用微卫星序列确定遗传性变异基因的存在与否和位置变化，足很有用的方式。微卫星(Microstellite)是广泛分布于不同染色体上的一些简单重复序列，通常由2～4个核苷酸反复重复排列组成。每个个体同一等位基因上这种序列重复的次数不同，故序列的长度不同，呈多态性。迄今已发现6000余个微卫星序列。

自1992年起，法国人开始将微卫星序列作为标志物之一做基因图谱，将染色体上的基因划分开来，每个标志物之间的距离缩小到了1000kb，称为第二代基因图谱。

近年人们利用微卫星序列研究遗传病基因的突变和丧失取得了很多进展，由于微卫星序列已被定位于各个染色体上，每条染色体可被微卫星分成若干区域，根据这些微卫星标记，可以将致病基因的位置定出并局限于最小范围。

如果发现一个家系有2例同样一种遗传性疾病，就可以用微卫星序列做基因的连锁分析，定位克隆出未知的致病基因。与遗传有关的基因许多已经通过微卫星克隆或定位。

寻找家族易感基因的基本方法是连锁分析(Linkage analysis)法，即在获得遗传性疾病的家系后，取得不同家族成员(包括正常人和患者)的血样品，提取DNA，以位于不同染色体位点的微卫星结构作为标志物，分析每个成员在不同位点的状态，比较同一位点上不同成员的状态，如果发现在同一位点上家族中患者总是共有同样的等位基因，则意味着该处可能存在致病基因，在相邻部位进一步取微卫星做上述研究，则可将基因定位并克隆。

现在已经有现成的克隆基因的试剂盒，内容包括23对染色体上各10～20个微卫星位点的荧光标记引物，检测基因组200～400个基因定位点，如果发现哪些基因与患者表型连锁，就可以进一步做细致的定位克隆。

许多遗传病，肿瘤都发现存在微卫星序列的杂合性丢失(LOH)和不稳定性(MSI)现象。杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)现象是来自父亲或母亲一方的等仪基因发生了缺失。如果发现某一肿瘤有许多病例孜某一染色体位点有较高的LOH发生率，往注标志这一位点存在这种肿瘤的抑癌基因。

大约75％的大肠癌显示有染色体17p和18q的LOH，50％的大肠癌显示有5q的LOH，后来发现5q上的APC／MCC、17P上的p53以及18q上的DCC是抑癌基因。据报告5q21的LOH可发生在21％～40％的非小细胞肺癌、80％的小细胞肺癌以及77％的食管癌中。散发性大肠癌中DCC位点LOH的发生率为71％。

消化道癌中有61％显示有DCC基因LOH，18q的LOH可出现在64％的骨肉瘤、60％的卵巢癌、33％的肾肿瘤、11％的肺癌。在散发性乳癌中，5q21(APC／MCC基因)的LOH发生率是28％；18q21(DCC基因)的LOH发生率是31％；17p13(P53基因)的发生率是71％，以上三个位点中，2个或2个以上位点发生LOH的几率是24％。

由于DNA错配修复(DNA mismatch repair)功能的损害所造成的DNA不稳定性也可能是遗传病和肿瘤产生的原因之一。不稳定性可表现在微卫星在DNA复制后出现长度的变化，即微卫星结构的不稳定性(Microstellite instability，MSI)，这些长度的变化是由于细胞分裂时DNA复制过程中新合成的链在模板上沿复制方向向前或向后滑动所造成的，脆性X综合征，强直性肌营养不良等许多遗传病与基因不稳定有关。

肿瘤只是瘤细胞出现变异，将同一病人的肿瘤及正常组织DNA进行微卫星结构的PCR扩增电泳，用肿瘤DNA所形成的区带与正常组织相比，如果肿瘤组织DNA可产生多余的条带，则表示肿瘤中存在遗传不稳定性或称修复错误(repair error，RER)。

最早发现遗传性非息肉性大肠痈(hereditory non-polosis colorectal cancer，HNPCC)有MSI，近来在非遗传性大肠癌甚至其它肿瘤(包括胰腺癌，胃癌，乳腺癌，前列腺癌等)也发现MSI现象。

在HNPCC中，MSI发生宰高达80％～90％，散发大肠癌发生率较低，为15～40％。在其它散发性癌中，胰腺癌MSI发生率较高(66.7％)，留癌为38石％，但在低分化胃痫中高达64％。食管鳞癌3p微卫星MSI的发生率为60％。

卵巢癌9q上一个位点以上MSI的发生率为59％，前列腺癌MSI的发生率为37.5％，低分化腺癌为63.6％，D期转移癌为46.7％，与高中分化癌有统计学差异。在非上皮肿瘤中MSI报合不多。MSI是出现在某些染色休上的某些基因还是影响所有的基因尚无定论。

微卫星作为多态性标记，因其在染色体上有明确的定位，可以广泛用于克隆新的遗传病相关基因和肿瘤的抑癌基因、预测发病趋势、评价治疗效果和估计预后，为基因在染色体细致定位提供了一个新工具。

二、PCR检测单核营酸多态性

人类基因组后计划除了研究基因组结构与功能以外，将以人类致病基因组和药物敏感基因组为研究的重点。

研究致病和药物敏感性基因组不仅具有极其重要的理论价值，而且亦有十分重要的实际意义和社会经济效益，其中单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)的分析是主要的研究途径和方法。用单核苛酸多态性做基因分析是从1998年刚刚发展起来的，特指人类基因组中大量存在的单个核苷酸的变异。

正常人不同个体的核苷酸序列都有一定的差异，它决定了不同人种和群体的差异，目前推断人基因组至少有30万个SNP，基因上每500bp～1000bp就有一个SNP.与所谓第二代基因图谱的微卫星串连重复序列相比，SNP是一个具有高度稳定性的遗传学标记，是一种新一代的人类基因标记。

SNP不仅是人类种族和个体差异的标记，亦是决定不同人群疾病、易感性和药物治疗敏感性的标记，可以成为寻找疾病相关基因，进行疾病诊断、预防和药物筛选的基础。

目前SNP研究主要包括2个方面：一是确定人类究竟有多少SNP，从1999年的文献报告分析，多数研究上利用基因库资料和序列标签位点(STS)在不同染色体上分段工作，基本方法包括PCR直接扩增相关基因后测序，SSCP，异源双链分析，探针杂交，限制酶分析等，许多实验方法已经有了自动化仪器。为了加速进展，有些先进实验室开始利用基因芯片，一次分析更多的位点。

在国际互连网络上已经建立了很多SNP网站供研究者查询和比较。二是直接利用一些患病家系，选择与该两致病有关的候选基因上的SNP做连锁分析。

例如Halushka 1999年6月报告高血压病75个候选基因上874个候选SNP，认为一些SNP与发病有关；Mein 1998年报铅分析394个糖尿病家系的染色体6上的MHC附近候选致病基因和位于染色体10、16等上致病候选基因的SNP，通过SNP寻找致病基因。

Becker l999年用SNP分析自身免疫病的候选基因，认为与补体C6、7、8无关。候选送因上的SNP均依据作者以往工作的经验或者通过计算机查询国际一些大基因库进行比较分析后选择。