闲聊PCR

各位先生，各位女士，各位来宾，各位领导，各位海外侨胞，港澳同胞，

欢迎参加两位新人的结婚晚会

哦 啊 拿错了， 这是我明天参加婚礼的发言

这个才是

各位战友 我们来聊聊PCR ：）

PCR可以说是目前分子生物学实验中应用最为广泛的一种技术。从最初的在几个水浴锅里把试管放来放去，到现在各种先进的PCR仪， 到REAL TIME PCR。 设备是越来越先进，方法是越来越多，但基本的原理还是那套。然而实际操作中，仍然有很多的问题让人头疼。正好看到有人建议来个PCR讨论区，就信手来了这么一篇，希望能抛砖引玉 顺手牵羊 大海捞针 针锋相对 对对对 对不上来了.

PCR的原理： 别 别 别砸我，只是个标题，在这里写PCR原理实在是浪费大家时间

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增加PCR的特异性：

一、primers design

这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件

a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量

b. GC% 40%~~~~60%

c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性

d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC

e. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER

f. 避免3'端的错配

g. 避免内部形成二级结构

h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不需要加上这些序列,但在检测互补 和二级结构是要加上它们

i. 需要使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用 较高的引物浓度(1uM-3uM)

j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online　desgin et al.

* 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。

设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。

有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。

根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃

或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

二、stability of primers

定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。

引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。

应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。

以大于10μM浓度溶于TE的引物在 -20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。