内切酶在PCR反应产物中的活性(Activity of Restriction Enzymes in a Primer Extensio

通常PCR反应以后还要对产物进行酶切才能进入下一步工作。为了方便起见，我们可以将内切酶直接加入到PCR反应产物中去，而省略了纯化产物的步骤。下表归纳了在PCR产物混合物中各种限制性内切酶的酶切活性。

酶切反应条件如下：在20 µl PCR产物混合体系中加入5U的内切酶，按相应的反应温度温育1小时。通常20 µl PCR产物体系中含有1 µg底物DNA，1单位的Vent DNA聚合酶，1× ThermoPol Buffer [10 mM KCl， 20 mM Tris-HCl （PH 8.8@25℃），10 mM (NH4 )2 SO4 , 2 mM MgSO4和0.1% Triton X-100]，以及终浓度为200 µM的dNTPs。表中标记有*的内切酶在酶切反应前需加入NaCl（终浓度为100 mM）或相应的10× NEBuffer（1×终浓度）。

注意：在非最佳条件下进行酶切反应容易出现星号活性。要避免星号活性或希望取得更好的酶切效果，则需用乙醇沉淀纯化DNA，再将其溶解于相应的酶切缓冲液。此外，如果使用不纯的DNA聚合酶，会因其中混有其它核酸酶而影响整个反应结果。

+++表示完全切割；++表示约50%被完全切割；+表示约25%被完全切割。

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酶     在反应物中的活性 　　Acc I      +   　　Acc65 I   + +   　　Aci I        + + +   　　Acl I     + +   　　Afl II     + + +   　　Afl III   + +   　　Age I   + + +   　　Ahd I   + +   　　Alu I   + + +   　　Alw I   + +   　　AlwN I   + +   　　Apa I   + ++   　　ApaL I   + + +   　　Apo I   + +   　　Asc I   + + +   　　Ase I   +   　　Ava I   + + +   　　Ava II   + +   　　Avr II   + + +    　　none  　　BamH I   + + +  　　Ban I   + + +   　　Ban II   + + +   　　Bbs I   + + +   　　Bbv I   + +   　　Bcg I   + +   　　BciV I  + +   　　Bcl I   + + +   　　Bfa I   none  　　Bgl I   +   　　Bgl II   + + +   　　Blp I   + + +   　　Bmr I  + + +  　　Bpm I   + +   　　Bsa I   +   　　BsaA I   + + +   　　BsaB I   + +   　　BsaH I   + + +   　　BsaJ I   + + +   　　BsaW I   + +   　　BseR I   + + +   　　Bsg I   + +   　　BsiE I   + +   　　BsiHKA I *   + +   　　BsiW I   + +   　　Bsl I  + +   　　Bsm I   + + +   　　BsmB I   + +   　　BsmF I   + +   　　BsoB I   + + +   　　Bsp1286 I   + + +   　　BspD I   + +   　　BspE I *   + + +   　　BspH I   + +   　　BspM I   none  　　Bsr I   + + +   　　BsrB I   + + +   　　BsrD I   + +   　　BsrF I   + +   　　BsrG I   + +   　　BssH II   + +   　　BssK I   + +   　　BssS I   + + +   　　BstB I   + + +   　　BstE I   + + +   　　BstN I   + +   　　BstU I   + +   　　BstX I   + + +   　　BstY I   + +   　　BstZ17 I   + +   　　Bsu36 I   + + +   　　Btg I  + + +  　　Bts I  + + +   　　Cla I   + +   　　Dpn I   (none, requires methylated substrate)   　　Dpn II   + + +   　　Dra I   + +   　　Dra III *   + + +   　　Drd I   + +   　　Eag I   +   　　Ear I   + + +   　　EcoN I   + +   　　EcoO109 I   + + +   　　EcoR I   + +   　　EcoR V   + + +   　　Fok I   none  　　Fse I   + + +   　　Fsp I   + +   　　Hae III   + + +   　　Hga I   + + +   　　Hha I   + +   　　Hinc II   + +   　　Hind III   + + +   　　Hinf I   + +   　　HinP1 I   + + +   　　Hpa I   + + +   　　Hpa II   + + +   　　Hph I   + + +   　　Kpn I   + + +   　　Mbo II   + + +   　　Mfe I   + +   　　Mlu I   + +   　　Mly I  + + +  　　Mnl I   + + +   　　Msc I   + +   　　Mse I   + +   　　Msl I   + + +