PCR-SSCP注意的事项

SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法，为了使SSCP达到最佳效果，应注意下列事项。

1. 重复性

影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度。这两个条件保持不变，SSCP图谱可保持良好的重复性。

一般SSCP图谱是二条单链DNA带，但有时有的DNA片段可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象。有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果。

2. 靶DNA序列长度的影响

在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故。而有人认为在DNA链较短的（400 bp 以下）情况下，DNA的长度不会影响SSCP的效果。他们仔细选择了实验条件，发现354 bp 的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以上。

3. 电泳电压和温度的影响

为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温度下进行（一般4℃~15℃之间）。在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较高的电压（250 V），以后用100 V左右电压进行电泳。

这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高。随后的低电压电泳可以使之进一步分离。在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压。

4. DNA片段中点突变的位置

点突变在DNA和RNA中的位置对SSCP检测率的影响，取决于该位置对维持立体构象作用的大小，而不是仅仅取决于点突变在DNA链上的位置（有人认为点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来）。

White曾设计了一组样品DNA片段，并将其中的点突变设在DNA链的中部，而且该点又正处在发夹结构顶端的环上，结果发现SSCP只能检测出9个样品中的2个（检出率为22%），说明DNA链中任何部位的突变，只要对其单链立体构象没有影响，都有可能被漏检。

5. SSCP的结果断定

由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分离不能反映出分子量的大小。有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出两者之间的差别。因此一般要求电泳长度在16~18 cm 以上，以检测限为指标来判定结果。 检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值。大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化。例如，一般检测限定为3 mm，那么当两带间距离在3 mm 以上，则说明两链之间有改变。另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果。另外，SSCP分析中其它条件，如PCR产物的上样量，PAG的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具体实验进行选择确定。 总之，SSCP分析法是一种快速、简便、灵敏的突变检测方法，适合临床实验室的要求。它可以检测各种点突变，短核苷酸序列的缺失或插入。随着SSCP分析不断完善，它将成为基因诊断研究的一个有力工具。