制备凝胶板的方法

等电聚焦电泳与琼脂糖电泳过程中凝胶板的制备方法和简单操作

等电聚焦电泳 １.制备凝胶板 1)30%凝胶母液的制备 丙烯酰胺30克，N、N双甲叉丙烯酰胺0.8克，加蒸馏水至100毫升，溶解后过滤,贮存于有色瓶内． 2)准备制胶模具 准备玻璃板凉快，相应压条三根．同样大小的玻璃纸及聚碳酸脂薄膜各一张（也可不用）．文具夹若干．上述用品洗净晾干后备用． 先将玻璃纸用蒸馏水浸透，平放在一块玻璃上，放三根压条于其上（这样就形成一个胶室），再放聚碳酸脂薄膜，最后放一张玻璃板，放压条的地方用文具夹夹紧，两块大约错开一公分，以备由此处灌胶． ３）聚丙烯酰胺凝胶板的制备 　　　取30%凝胶母液3.2毫升，依次加50%分析纯甘油3.6毫升,双蒸馏水10毫升，40%载体两性电解质0.72毫升，10%过硫酸胺0.1毫升，（最好用时配制，或在制备一周内使用），充分混合后，从框垫开口处注入玻璃板夹层内的玻璃纸和聚碳酸脂薄膜之间的空间内，室温放置1小时左右，去掉文具夹及聚碳酸脂薄膜及其上的玻璃板，既为聚丙烯酰胺凝胶板． 4)打开低温循环器开关使水温降至4℃左右． ２.加样 　　　用1*0.5(或0.6*0.5)厘米滤纸片在0.1-0.5%浓度的样品液中浸润，贴于凝胶板1.5-2厘米处，与凝剿班的方向平行，每个样品滤纸片间隔0.5厘米． ３.电泳 1）放置电级纸条，以3-4层宽0.6-1.0厘米、长10厘米的干滤纸条以1mol/L氢氧化钠置于凝胶板阴级侧的边缘，同样的滤纸条浸以1mol/L磷酸置于阳极侧的边缘． 2)将铂金丝电极板放于凝胶板上，使连接电源阳极和阴极的电极丝分别压在阳极侧和阴极侧的电极滤纸条上，最后盖好电泳槽盖． 3)接通电源开关，按下＂预置＂开关键，预置电压、电流及功率的参考值分别为2500V、50mA、功率80W．然后按下开关键，电源即有输出，电泳开始．一般选择稳压或稳功率，电泳时间1-1.5小时． 4.固定 　　电泳结束后，凝胶板以12.5%三氯醋酸固定20分钟． 5.染色 　　取0.4克考马斯亮蓝R250加入120毫升甲醇液中20克三氯醋酸，12克磺基水杨酸，蒸馏水400毫升，制成考马斯亮蓝染色液，将经固定的凝胶板放置于染色液中，60℃水浴中染色30分钟．　 6.脱色 　　乙醇、冰醋酸及蒸馏水按1:3:6的比列缓和即为脱色液．将染色后的凝胶板放置于该脱色液中，室温下脱色24－43小时． 7.绘PH曲线（此步骤需在电泳结束后，固定之前进行），测等电点． 8.照相 凝胶板干燥处理后保存或照相后保留底片．

琼脂糖电泳 1.先用胶条封住凝胶托盘两端，然后放在水平台上．把试样格固定在试样格架上，放在凝胶托盘合适的位置上．把配置好的琼脂糖凝胶倒如槽中（主义琼脂糖凝胶的温度不要超过60℃）．待凝胶聚合后，轻轻拔掉试样格． 2.在电泳槽两端活动槽中加上缓冲液，把凝胶托盘两端的胶条撕掉并移到电泳槽中． 3.用与凝胶等同宽度的四层滤纸约20mm长，并折成直角；滤纸的一端搭在凝胶板上，另一端浸在缓冲液中． 4.点样． 5.插上电源线，接同电源开始电泳． 6.主义不要接错正负极，检查无误后打开电泳仪电源开关．根据凝胶板的薄厚选择适宜的电压与电流即可电泳． 7.电泳实验结束后，先关闭电泳仪电源开关；随之打开电泳槽取出凝胶托盘． 8.观察和照相：在254nm或300nm紫外灯下观察，或用135照相机加橙色滤光片在紫外分析仪上照相．