质粒DNA限制性酶切与琼脂糖凝胶电泳分离验证实验操作步骤

重组DNA技术工具酶

琼脂 糖凝胶电泳是分子实验的基础技术，电泳迁移速率主要受到一些因素影响DNA的分子大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、嵌入染料的存在、电源电压、离子强度影响。

实验原理

一、DNA的限制性内切酶 酶切分析

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:I类和III类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。

III类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。

Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA 的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为 4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'), 有少数酶识别更长的序列或简并序列。

Ⅱ类酶切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3'); 有的切割位点在对称轴一侧, 产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'

3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。

二、凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法(如密度梯度离心法)所无法分离的DNA片段。

当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色, 在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外, 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带, 用于以后的克隆操作。

琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质, 其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中, 在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移, 其迁移速率由下列多种因素决定:

1. DNA的分子大小:

线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

2. 琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子, 其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb 的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%, 分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

3. DNA分子的构象

当DNA分子处于不同构象时, 它在电场中移动距离不仅和分子量有关, 还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的, 超螺旋DNA移动最快, 而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时, 可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收, 用同一种限制性内切酶分别水解, 然后电泳, 如在凝胶上出现相同的DNA图谱, 则为同一种DNA。

4. 电源电压

在低电压时, 线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长, 片段越大, 因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过 5v/cm。

5. 嵌入染料的存在

荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA, 染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15%。

6. 离子强度影响

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶), 电导率最小, DNA几乎不移动, 在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液), 则电导很高并明显产热, 严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

试剂和器材

一、试剂：

l0×TBE缓冲溶液(0.89mol/L Tris–0.89 mol/L硼酸–0.025 mol/L EDTA缓冲溶液)：取

108g Tris，55g硼酸和9.3g EDTA(EDTANa2 · 2H20)溶于水，定容至1 000mL，调pH 8.3。作为电泳缓冲溶液时应稀释10倍。

6×电泳加样缓冲液：0.25% 溴粉蓝，40%(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。

溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml, 用铝箔或黑纸包裹容器, 储于室温即可。

二、 材料

λDNA: 购买或自行提取纯化;

重组pUC19质粒;

EcoRI酶及其酶切缓冲液;

HindⅢ酶及其酶切缓冲液;

琼脂糖(Agarose)。

二、 器材

电泳仪, 台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉, 琼脂糖凝胶成像系统。

操作方法

一、 DNA酶切反应

1. 用微量移液枪向灭菌的eppendorf管分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μL, 再加入去离子水使总体积为19μL, 将管内溶液混匀后加入1μL酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀, 也可用微量离心机甩一下, 使溶液集中在管底。

2. 混匀反应体系后, 将eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上), 37℃水浴保温2-3小时, 使酶切反应完全。

3. 每管加入2μL 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混匀, 以停止反应, 置于冰箱中保存备用。

二、DNA分子量标准的制备

采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA为长度约50kb的双链DNA分子, 其商品溶液浓度为0.5mg/mL, 酶解反应操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8个片段, 长度分别为23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6个片段, 长度分别为21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。

三、 琼脂糖凝胶的制备

1. 取10×TBE缓冲液20mL加水至200mL, 配制成1×TBE稀释缓冲液, 待用。

2. 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖, 置于200ml锥形瓶中, 加入50mL 0.5×TBE稀释缓冲液, 放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化, 取出摇匀, 此为0.8%琼脂糖凝胶液。

3. 胶板的制备：将有机玻璃胶槽置于水平支持物上, 插上样品梳子, 注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。 向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液其终浓度为0.5μg /mL(也可不把EB加入凝胶中, 而是电泳后再用0.5μg/mL的EB溶液浸泡染色)。

用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封有机玻璃胶槽两端内侧, 待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内, 使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低, 否则凝固不均匀, 速度也不可太快, 否则容易出现气泡。

待胶完全凝固后拨出梳子, 注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。

4. 加样：取10μL酶解液与2μL 6×加样缓冲液混匀, 用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低, 则可依上述比例增加上样量, 但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换枪头, 以防止互相污染, 注意上样时要小心操作, 避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

5. 电泳：加完样后, 接通电源。控制电压保持在60-80V, 电流在40mA以上。当溴酚蓝条带动到距凝胶前沿约2cm时, 停止电泳。

6. 染色： 未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/mL的EB溶液中, 室温下染色20-25分钟。

7、 观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的荧光条带。

注意事项

(1) 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。

(2) 酶活力通常用酶单位(U)表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1μg λDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象λDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。

(3) 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液(1×)进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。

(4) 观察DNA离不开紫外透射仪, 可是紫外光对DNA分子有切割作用。 从胶上回收DNA时, 应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm), 以减少紫外光切割DNA。

(5) EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。

(6) 当EB太多, 胶染色过深, DNA带看不清时, 可将胶放入蒸馏水冲泡, 30分钟后再观察。

本文总结了质粒DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳的原理；DNA酶切反应和琼脂糖凝胶的制备过琼等琼脂糖电泳操作步骤，需要注意的是EB是致癌物质，应避免自己免受EB的伤害。