双向电泳各部分操作大全

1. 总的策略

① 化学试剂纯度要高，至少是分析级，目前国产试剂达不到纯度要求 ② 使用去离子水(电导<2uS) ③ 尿素和丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺需新鲜配制 ④ Deionize urea prior to use ⑤ 包含尿素的溶液加热温度不超过 37℃，否则会发生蛋白质氨甲酰化NBS p;过滤所有的溶液，使用干净无灰尘的容器

2. 样品制备

① 样品提取缓冲液(裂解缓冲液)必须新鲜配制。或者分装成 1ml，于-78℃冷冻保存， 裂解缓冲液一旦溶解不能再冷冻 ② 如有必要，在细胞裂解时加入蛋白酶抑制剂。注意：几种蛋白酶抑制剂在 DTT 或b-巯基乙醇存在时失效 ③ 40000g 离心 1 小时以去除蛋白提取液中的不溶物

3. 灌胶

① 过硫酸铵溶液需新鲜配制。40%过硫酸铵溶液储存于冰箱中只能使用 2-3天，低浓度过硫酸铵溶液只能当天使用 ② TEMED 需在氮气下储存，每 6 个月换一次 ③ 带 U 型框的玻璃板需用疏水硅烷处理，避免胶聚合后与玻璃板粘连 ④ 水平 SDS 浓缩胶中加入甘油(37.5%)的目的是为了减少电内渗 ⑤ 如果 SDS 胶结合于 GelBond PAG 膜上， GelBond PAG 膜需用去离子水 洗 6 次，每次 10 分钟， 以避免银染过程中产生点托尾

胶聚合不完全的可能原因解决办法TEMED 或过硫酸铵时间太长替换 TEMED 和过硫酸铵SDS 胶：Tris 缓冲液的 pH 值用 HCl调 Tris 缓冲液的 pH6.8 或 8.8胶从塑料支持膜上脱落的可能原因解决办法胶聚合于 GelBond PAG 膜的疏水面胶必须聚合于 GelBond PAG 膜的亲水面塑料支持膜选择错误(如：用于琼脂 糖胶)选择专门用于聚丙烯酰胺胶的支持膜GelBond PAG 膜过期不要使用超过一年的 GelBond PAG 膜胶结合于玻璃板上的原因解决办法玻璃板没有疏水处理玻璃板用疏水硅烷处理

4. IPG 胶条的水化

①PG 胶条需水化到 0.5mm 厚 ② IPG 胶条的的水化时间取决于水化缓冲液的组成。如果尿素(>8M)和去污剂(>1%)浓度过高，至少需水化 6 小时，最好过夜 ③采用 Multiphor II 做第一向电泳时，水化后的 IPG胶条需用去离子水 清洗，否则 IPG 胶条表面会有尿素结晶，干扰 IEF。(使用 IPGphor 时，IPG胶条水化后不必清洗) ④IPG 胶条水化时，其胶面与水化盘或胶条槽之间避免产生气泡。采用胶条槽水化时，胶条上需覆盖硅油以防水化液挥发

5. 第一相 IEF

①采用样品杯上样：样品体积不能少于 20&mu;l 样品在阴极或阳极附近上样，未知样品需检查在何处上样，结果更好;样品浓度不能过高(最大 10mg/ml)，以避免在上样位置生成蛋白沉淀。如果怀疑，最好用裂解缓冲液稀释，增大上样体积 样品溶液中不能含高浓度的盐。脱盐或用裂解缓冲液稀释，低电压使样品慢慢进入胶中

② 水化时加入样品 样品溶液体积需根据 IPG胶条大小调整(18cm长 IPG胶条约需 400&mu;l样品溶液)，以保证水化后没有多余的样品留在水化盘中。最好检查高分子 量蛋白、碱性蛋白或膜蛋白是否进入 IPG胶中

③ 等电聚焦 使用 IPG 胶条时，不要进行预聚焦，否则会因为胶的电导非常低导致样品很难进入胶条;为使样品进入胶的效率增加，采用 30V 低电压水化;继续以低电压梯度(200V，500V，1000V 各 1 小时)进行电泳，最后达到 8000V 的进行电泳;聚焦时间跟 IPG 胶条的长度、pH 范围有关。短的 IPG胶条或宽 pH 梯度范围 IPG 胶条，聚焦时间短 IEF 结束后，如果 IPG 胶条暂时不进行第二向电泳，可于-78℃ 冷冻保存;上样附近有水析出是因为样品盐浓度过高，可脱盐或稀释样品，低电压上样，延长样品进入胶的时间

6. IPG 胶条平衡和第二相(SDS-PAGE)

①平衡时间应该充分长(至少 2 x 10 分钟) ②平衡缓冲液包括 Tris-HCl(pH8.8),SDS(1%),高浓度尿素(6M)和甘油(30%)提高蛋白质的溶解度并减少电内渗。第一步加入 DTT(1%)是为了使蛋白去折叠;第二步加入碘乙酰胺是为了去除多余的 DTT(银染过程中，DTT 会导致点拖尾)③对于非常疏水的蛋白或含有二硫键的蛋白，相对于 DTT 和碘乙酰胺，tributylphosphine 更有效 ④水平的 SDS-PAGE：浓缩胶中加入大量的甘油(37%)是为了减少电内渗⑤水平的 SDS-PAGE：浓缩胶的长度至少超过 25mm ⑥ 蛋白从一向(IPG 胶条)到二向(SDS 胶)的转移为避免点拖尾和损失高分子量蛋白，应缓慢进行(场强<10V/cm)

SDS 胶垂直拖尾的可能原因解决办法水平 SDS-PAGE：浓缩胶长度太短有效的浓缩胶长度>25mm蛋白没有被 SDS 充分包裹平衡缓冲液 SDS 浓度>1%，平衡 2 x 15分钟糖蛋白用硼酸缓冲液代替 Tris 缓冲液用宽范围小孔梯度胶蛋白去糖基化部分自由的巯基再次氧化生成二硫键聚合物衡缓冲液中加入充足的 DTT，使蛋白烷基化用 tributylphosphine 代替DTT和碘乙酰胺蛋白发生氨甲酰化含有尿素的溶液加热温度不能超过 37℃使用前，尿素去离子化(deionize urea)样品制备时，内源的蛋白酶没有被抑制TCA-丙酮处理使蛋白酶失活加 SDS 或蛋白酶抑制剂一起煮沸GelBond PAG膜使用前没有清洗使用前，用去离子水洗 6 x 10 分钟灰尘或多余的 DTT过滤所有的缓冲液 第二步平衡缓冲液中加入碘乙酰胺去除多余的 DTT双向电泳图谱部分变形的可能原因解决办法IPG 胶条中 NP-40 或 Triton X-100浓度过高如果可能减少 NP-40/Triton的量用 CHAPS 代替 NP-40/Triton蛋白从一向到二向转移完成后，IPG胶条没有从水平的 SDS 胶上取走第二向采用水平 SDS-PAGE 时,蛋白从一向到二向转移完成后，取走 IPG 胶条缓冲液条没有覆盖 SDS 胶上原IPG 胶条结合的位置第二向采用水平 SDS-PAGE 时，取走 IPG胶条后，将缓冲液条前移，恰好覆盖 IPG胶条与 SDS 胶结合位置的前沿溴酚蓝迁移前沿不平的可能原因解决办法水平 SDS-PAGE ： 冷却板和GelBong PAG膜之间有气泡去除气泡水平 SDS-PAGE：缓冲液条和胶面结合不好轻压缓冲液条，使其与胶面充分结合SDS 小孔梯度胶灌胶和聚合时不水平采用水平台灌胶