DNA印迹（Southern Blot )

【实验目的】

掌握DNA印迹技术的基本原理， 学习DNA印迹技术的操作方法，了解DNA印迹技术的应用范围。

【实验原理】

DNA印迹是1975年由英国Southern创建的。

其基本原理是：DNA分子经限制性核酸内切酶酶切后，由琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子质量大小分离，然后将DNA片段变性，并使凝胶中的单链DNA片段转移到尼龙膜、硝酸纤维素膜(NC)或其他固相支持物上，此法中DNA片段由液流携带通过虹吸作用由下向上抽吸，从凝胶转移印至滤膜表面。

然后与相对应结构的已标记的探针进行杂交反应，用放射性自显影或酶反应显色来鉴定待测DNA分子。

DNA印迹技术主要用于对基因组DNA的定性和定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性(RFLP)等。

【实验对象】

待测DNA。

【试剂与器材】

(1) 水平电泳装置，电泳仪，紫外灯，摇床。

(2) 待测DNA，琼脂糖，溴化乙啶，DNA探针，保鲜膜，缓冲液。

(3) 0.25 mol/L HCl

(4) 变性液：1.5 mol/L NaCl; 0.5 mol/L NaOH (保存于室温)。

(5) 中和液： (pH 7.0) 5 mol/L NaCl; 0.5 mol/L Tris-HCI (保存于室温)。

(6) 转移液 (20×SSC pH 7.0)：用800 ml H2O溶解175.3 g NaCl和88.2 g柠檬酸钠，以浓 HCI调pH至7.0，用双蒸水定容至1 L。分装后高压灭菌。

(7) 2×SSC。

(8) 尼龙膜或硝酸纤维素 (NC) 膜。

【实验方法与步骤】

(1) 取适量已酶切充分的待测DNA (1 μg左右) ，于0.8%~1.25％的琼脂糖凝胶上与合适的 DNA分子量标准一同进行稳压电泳。

(2) 切去凝胶一角以标记方向，用溴化乙啶染色后拍照记录电泳结果 (拍照时，凝胶旁放一尺子，便于以后对照电泳带在膜上的位置) ，再切下一侧DNA分子量标准带。

(3) 处理凝胶以备转膜。

1) 蒸馏水短暂漂洗凝胶(轻摇)。

2) 将凝胶浸没入10倍于凝胶体积(约30min)的0.25mol/L HCl溶液中15~30min，使DNA脱嘌呤。蒸馏水短暂漂洗凝胶2次。

3) 将凝胶浸没入10倍体积的变性液中20min，2次，蒸馏水漂洗2次。

4) 将凝胶浸没入10倍体积的中和液中20 min，2次，使变性液被中和。

(4) 在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等。

(5) 安装虹吸转移装置：如图25-3所示，将一固体支持物置于盛有足以浸没其一半高度的20× SSC的平皿中，依次将1张Whatman 3 mm滤纸桥，3张Whatman 3 mm 滤纸，凝胶，叠放于固体支持物上，用塑料薄膜包裹凝胶边缘后。

将1张在蒸馏水中平衡过的尼龙膜(或用蒸馏水浸湿，然后在20×SSC中平衡10min的NC膜)，5张Whatman 3mm滤纸及一叠4cm纸巾塔依次置于凝胶的上部，再放一玻璃板，其上压重物(注意：凝胶与转印膜间应避免有气泡，滤纸、吸水纸巾等必须大小一致)。转移持续4 h以上或过夜，勿使转移液干枯。

(6) 使已转移的DNA与膜交联：取出转印膜，用铅笔在膜上标记样品孔的位置，并切去一角以标示方向。用2×SSC漂洗转印膜，然后将其放在一张Whatman 3mm滤纸上，有DNA的一面朝上，使其完全干燥。再将膜置于UV crosslinker中，在紫外光下自动交联或将NC转印膜置于可透过紫外线的塑料夹层中，带有DNA的一面朝下，置于紫外透射仪(波长在254 nm)上，以合适的照射强度进行紫外线交联，以固定DNA。

(7) 用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜后，将其夹于2张Whatman 3 mm滤纸之间，80℃真空干烤2h或空气干燥。转印膜干燥后可夹在2张Whatman 3mm滤纸之间，室温下放置数月。备做核酸杂交实验。

Southern Blot仅仅是将待测DNA片段从电泳凝胶中转移并固定到固相支持物上，要实现DNA探测还需完成核酸杂交实验（包括探针标记、杂交和检测三个后续实验步骤）。杂交的双方是待测核酸序列和探针，二者按碱基互补原则退火形成双链。

探针是用于检测的已知核酸片段，根据标记物的不同可分为放射性(同位素)标记探针和非放射性(非同位素)标记探针。放射性标记的探针，是在探针制备过程中掺入32P-dNTP而实现放射性标记的。非同位素标记物有生物素(biotin)、地高辛(dig-oxigenin，Dig)和荧光素(Fluorescein)等。待测核酸与探针杂交后，通过放射自显影、化学显色或直接在(荧光)显微镜下观察杂交信号来鉴定待测核酸分子的大小及含量(方法见第六节后附录一和附录二)。

【注意事项】

(1) 在分辨核酸电泳带所需的凝胶浓度范围内，电泳中使用的琼脂糖凝胶的浓度越低越好，并且厚度应 ≤ 7mm。转印前切去凝胶多余的边缘，因为凝胶边缘多比凝胶本身要厚，与滤膜很难紧密相贴。

(2) 电泳结束后，应在紫外检测仪下仔细观察酶切是否完全、电泳分离效果是否良好、DNA样品有无降解、样品量是否一致、是否有因电场强度不均匀导致样品带泳动速度不一致等。

(3) 戴手套以防手受酸碱溶液损伤，同时避免污染滤膜。取拿滤膜时使用平头镊子。

(4) 在转移过程中，如吸水纸巾全部润湿需及时更换，否则会造成缓冲液的逆流。

(5) DNA片段的大小决定其转移速度。小于1kb的DNA片段，1h即可完成转移过程。大片段 DNA的转移速度和效率则慢得多，如大于15kb的DNA片段需要18h以上。因此，当DNA片段长度大于15kb时需进行脱嘌呤(稀盐酸)及强碱水解处理，使之降解成较小的片段，从而提高转移效率。

　思 考 题

1. Southern Blot技术的基本原理是什么?

2. 影响DNA印迹效果的主要因素有哪些?

3. Southern印迹技术的应用范围有哪些?