WB转膜的条件设置

Western 免疫印迹（Western Blot）

Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

为利于更好的实验效果，不同蛋白，转膜条件略有不同，迪申生物技术（上海）有限公司专注于生产免疫组化相关产品多年，对 WB 实验有一定了解，今天跟各位同学一起分享下实验过程中发现的不同蛋白的转膜条件。

蛋白来源：RAW264.7 总蛋白

蛋白名称：一些转录因子

蛋白分子量：40~70 KD

WB 用膜类型、孔径：0.45 NC

转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒流 400 mA

转膜时间：60~90 min

PS. 其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要， 曾经因为失误，转了 15 min 就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。

蛋白来源：内皮细胞 总蛋白

蛋白名称：occludin & AKT

蛋白分子量：65 KD & 56 KD

WB 用膜类型、孔径：0.45 PVDF

转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒压 100 V

转膜时间：60~70 min

设备名字是「Bio-Rad mini」。

蛋白来源：肿瘤手术标本

蛋白名称：转录因子

蛋白分子量：33 KDa

WB 用膜类型、孔径：PVDF 膜

转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流

转膜时间：150 min

转膜设备：湿转 Bio-Rad

说明：相同条件曾用于数个 30-70 KDa 的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何； 实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。

蛋白来源：成纤维细胞

蛋白名称：smad3

蛋白分子量：54 KDa

WB 用膜类型、孔径：PVDF 膜

转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流

转膜时间：150 min

转膜设备：湿转 Bio-Rad

蛋白来源：肿瘤细胞

蛋白名称：磷酸化蛋白

蛋白分子量：10-200 KDa

WB 用膜类型、孔径：millipore PVDF 膜 0.45 um

转膜方式（恒压、恒流）：120 v 恒压

转膜时间：120 min

转膜设备：湿转 Bio-Rad

建议：转膜缓冲液只用 2 次，基本都转上，5%BSA 封闭，减少背景。

蛋白来源：Hepg2

蛋白名称：EGFR

蛋白分子量：170kd

WB 用膜类型、孔径：pvdf 0.45

转膜方式（恒压、恒流）：24V

转膜时间：2 个半小时

转膜设备：伯乐半干转

蛋白来源：肝癌细胞

蛋白名称：HIF-1α

蛋白分子量：120 kD

WB 用膜类型、孔径：NC 膜

转膜方式（恒压）：80 伏，湿转

转膜时间：150 分钟

设备：「Bio-Rad mini」

建 议：湿转，转膜液特别重要，否则会导致电压或者电流不稳影响转膜条带。转膜均现配先用，不重复利用。转膜时间一般是 150 分钟，80 伏恒压。经李春红染 色，靠近蛋白胶的一侧膜上蛋白染色深，膜另外一面染色浅，说明蛋白未转过。该湿转条件自己做过的蛋白分子量范围：170-36 kD。

蛋白来源：肺脏

蛋白名称：ICAM-1

蛋白分子量：85~110 KD

WB 用膜类型、孔径：0.22NC

转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒流 300 mA

转膜时间：120 min

设备名字 Bio-Rad mini

一抗用的 santa cruz 1 mL 包装的。 比例调整到 1：800 做出很好的条带。 效价会一直降低的。去年做的这个指标，今年夏天做就不行了。

蛋白来源：人肿瘤细胞

蛋白名称：磷酸化蛋白

蛋白分子量：30-60 KDa

WB 用膜类型、孔径：pall NC 膜 0.45 um

转膜方式（恒压、恒流）：恒流 0.85-1 mA/平方厘米膜

转膜时间：60-90 min

转膜设备: 北京六一 半干转

建议：转膜缓冲液用新鲜配制的，可先配成 2 倍的母液，转膜液的多少会影响电转的效率，一般将吸水纸润湿即可，不要和膜一起浸泡，这样效果很好。

蛋白来源：人肝癌肿瘤细胞

蛋白名称：notch

蛋白分子量：60-120 KDa

WB 用膜类型、孔径：pall NC 膜 0.45 um

转膜方式（恒压、恒流）：恒流 0.3 A

转膜时间：-20 度冰柜 120 min

转膜设备: 湿转 Bio-Rad

建议：转膜缓冲液用新鲜配制的，可先配成 10 倍或 5 倍的母液，保持低温是转膜效果的一个保证，这样效果很好。

蛋白来源：肺脏、肝脏等。

蛋白名称：actin

蛋白分子量：43 kD

WB 用膜类型、孔径：NC 膜 PALL 0.22 um

转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒流 200 mA

转膜时间：45~60 min

设备名字 Bio-Rad mini

用的 santa cruz 分装和整装的都可以。效价一般 1：1000-1：3000 左右，可稳定较长一段时间。

蛋白来源：细菌蛋白

蛋白名称：全部的可溶性蛋白

蛋白分子量：11-170 KD

WB 用膜类型、孔径：0.45 NC

转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒流 300 mA

转膜时间：80 min

蛋白来源：骨肉瘤 CELL LINE

蛋白名称：Beta actin

蛋白分子量：42 kDa

WB 用膜类型、孔径：Nitrocellulose Membrane 0.2 um Pore Size (Invitrogen)

转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒压 22 v

转膜时间：90 min

转膜设备：X-cell Sure Lock Mini-cell (Invitrogen)

建议改进方向：转膜过程冰水浴，保持低温，Transfer Buffer 重复使用。

蛋白来源：肾瘤细胞

蛋白分子量：39 kDa

WB 用膜类型、孔径：Nitrocellulose Membrane 0.2 um Pore Size (Invitrogen)

转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒压 100 v

转膜时间：50 min

蛋白来源：pichia 分泌表达

蛋白名称：细胞因子等

蛋白分子量：17 到 30 kDa

WB 用膜类型、孔径：millipore PVDF 0.45 um

转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒压：100 V

转膜时间：60 min

这个条件除了 100 KDa 的预染 maker 转的不好，剩下的条带都非常清晰。正向前面 ycwzq 说的，感觉时间不是很重要，只要蛋白别太小或太大，在一个比较宽的时间和电压范围都能转上。当然这些还有一个重要的影响因素就是所用的蛋白转印缓冲液。

蛋白来源：小鼠前列腺癌细胞

蛋白名称：P53 P21 RAD51 GAPDH

蛋白分子量：53 KDa、21 KDa、37 KDa、36 KDa

WB 用膜类型、孔径：PVDF 膜 0.45

转膜方式（恒压、恒流）：恒压 110 v

转膜时间：60 min

转膜设备: 湿转 Bio-Rad mini

蛋白来源： 来自 MDCK 增殖的流感病毒裂解物

蛋白名称：PB1

蛋白分子量： 96 kd（注意，10% SDS-PAGE，冰上电泳。用预染 marker 观察 100kd 的条带跑到胶的正中间位置时，才开始转膜，否则转膜效率降低）

WB 用膜类型、孔径： NC 膜， 0.45

转膜方式（恒压、恒流）：恒压，100V

转膜时间： 2 hours

转膜设备: BIO-rad 转膜设备。其间，准备一个冰盒，将电泳槽半埋到冰里。

转膜液的配制：（如甲醇的比例和是否加 SDS 以及多大质量浓度等）： 2.9 g 甘氨酸，5.8 g tris，0.37 g SDS，200 ml 甲醇。

蛋白来源： 软骨细胞

蛋白名称：b-actin

蛋白分子量： 43 kd

WB 用膜类型、孔径： PVDF 膜， 0.45

转膜方式（恒压、恒流）：湿转，恒流，350 mA

转膜时间： 85 min

转膜设备: BIO-rad 转膜设备。其间，准备一个冰盒，将电泳槽半埋到冰里。

转膜液的配制：（2.92 g 甘氨酸，5.8 g tris，0.375 g SDS，200 ml 甲醇，用双蒸水定容到 1 L）

蛋白来源：HepG2 细胞

蛋白名称：Akt 及 P-Akt

蛋白分子量：55KDa/56KD

WB 用膜类型、孔径：PVDF 膜 0.45 孔径

转膜方式（恒压、恒流）：100V 恒压

转膜时间：75 min

转膜设备: 湿转 Bio-Rad

蛋白来源：大鼠

蛋白名称：Bactin（42 KDa）

WB 用膜类型、孔径：PVDF（0.45）膜

转膜方式（恒压、恒流）：湿转 恒流 150 mA

转膜时间：100 min

转膜设备: 北京六一

蛋白来源： 大鼠大脑皮质

蛋白名称：b-actin

蛋白分子量： 43 kd

WB 用膜类型、孔径： PVDF 膜， 0.45

转膜方式（恒压、恒流）：半干转，恒流，2 mA/cm2

转膜时间： 8-55 min

转膜设备: BIO-rad 转膜设备。

转膜液的配制：（2.92 g 甘氨酸，5.8 g tris，0.375 gSDS，200 ml 甲醇，用双蒸水定容到 1 L）