western blot技术资料

试剂耗材：SDS、甘油、Tris、溴酚蓝、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED，APS、甘氨酸、甲醇、PVDF膜、Brandford蛋白定量试剂盒、BSA、脱脂奶粉、考麻斯亮蓝、丽春红、氯化钠、氯化钾、DTT、ECL、显影液、定影液等、显影胶片。

仪器设备：超声仪、核酸蛋白定量仪、Western-blot电泳转膜系统、摇床、曝光合、红灯等。

样本准备：收集106细胞，加入150μl SDS裂解液，冰上超声5次，定量。

SDS-PAGE 电泳：

1. 准备各溶液：小烧杯两个，5ml枪头6个，吸水纸，罐胶电泳设备。

2. 准备罐胶槽：将玻璃板擦干净，放入短架子内，薄板靠门，两玻璃板及架子的底缘须在同一平面（否则漏胶）；将湿润的垫片垫于长架子上并铺上密封膜；将短架子装在长架子上（短架子底缘须与垫片紧密接触，否则漏胶）。

3. 准备配胶。 将各溶液（ddH2O，单体，Tris-HCl，SDS，TEMED，APS）依次摆好，5ml枪头插于长罐胶槽，调好取TEMED、APS的枪。

4. 配分离胶：在一小烧杯上装半杯ddH2O；另一小烧杯依次加上述各液（加TEMED、APS时要迅速），快速摇匀。注：胶浓度由需要检测的蛋白大小决定。

5. 罐胶：从玻璃板中间注入胶液，注胶速度均匀，不要产生气泡。罐胶后用ddH2O压胶。

6. 等待时：将Tris-HCl换成pH6.8。换取Tris-HCl及罐胶用的枪头。调好各移液器。

7. 30分钟后：倒掉压胶水，用滤纸吸干残留水，注意不要触及胶面。

8. 配集成胶：见步骤4。

9. 罐胶：见步骤5，灌满为止，不要有气泡。

10. 插梳：梳柱下面不要有气泡。

11. 等待时：A---配电泳缓冲液。B---将样本煮沸5分钟。C---水中冷却，短暂离心后依加样序排放好。D---等胶近凝时，将玻璃板装在电泳架子上，罐内槽液于槽中，检查是否密封。E---将上槽架子按于槽中。

12. 30分钟后：罐上槽液超过短玻璃板，拔梳（注意力道适中，不能太快）。放置上样架子。

13. 上样30μl：枪头先伸入至快接近胶面时开始降将上样液缓缓打出，使样品液从胶面往上涨，枪头随液面上涨而上提。可以不把最后一滴样品打出，但是每个样品都须同样处理。

14. 加外槽液。

15. 电泳。

转膜：

1. 准备：分别准备泡膜和转膜用的试剂和用具，在电泳槽中倒好转膜液

2.揭胶：电泳结束后，将电泳槽移至水池中，倒掉电泳液，将内槽提起放在水池边，取出两边玻璃板。用纯水冲干净玻璃板，小心揭开短板，去掉集成胶，小心将胶转入转膜液在中。

3.转膜：将夹子打开，黑色在底，依次放置海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵，关好夹子（均在液面下进行，注意气泡）快速放入架子中。在电泳槽中放冰袋。

4.电泳。

封闭及孵抗体：

1. 转膜等待时 准备封闭液（即Non-fat milk 5% in TBST）。

2. 转膜完毕后， 将膜放入封闭液中，轻摇孵育1小时。

3. 孵一抗：将封闭好的膜在转移到一抗盒子中，室温孵育两小时或4℃过夜，

4. 洗涤：将孵育好一抗的膜在TBST洗涤3次，每次5分钟。

5. 孵二抗：将洗好的膜放在二抗中室温孵育两小时。

6. 洗涤：将孵育好二抗的膜在TBST洗涤3次，每次5分钟。

7. ECL化学发光和曝光显影。

western-blot凝胶浓度选择：